丁俊輝,袁 林,喻 晨,侯亞利,楊忠華,全 燦

(1.武漢科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院,湖北 武漢 430081;2.安琪酵母股份有限公司,湖北 宜昌 443000;3.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院 化學(xué)計(jì)量與分析科學(xué)研究所,北京 100013)

對(duì)鹵醇脫鹵酶的機(jī)制及其應(yīng)用已經(jīng)有相關(guān)報(bào)道,但對(duì)鹵醇脫鹵酶特別是新發(fā)現(xiàn)的鹵醇脫鹵酶還未見詳細(xì)的歸納與綜述。此外,對(duì)鹵醇脫鹵酶的分子改造及固定化等方面的研究進(jìn)展還未見相關(guān)報(bào)道。筆者在對(duì)新發(fā)現(xiàn)的鹵醇脫鹵酶歸納總結(jié)的基礎(chǔ)上,對(duì)鹵醇脫鹵酶的分子改造和固定化進(jìn)行總結(jié),為鹵醇脫鹵酶的研究提供新的研究資訊。

1 鹵醇脫鹵酶的主要來源及亞型

Castro等[6]首次在以2,3-二溴丙醇為唯一碳源的黃桿菌(Flavobacteriumsp.)中發(fā)現(xiàn)并分離出鹵醇脫鹵酶,之后從多種微生物中分離得到大量的鹵醇脫鹵酶。主要的鹵醇脫鹵酶的來源及亞型見表1。

表1 鹵醇脫鹵酶的產(chǎn)酶微生物及亞型

2014年以前,通常根據(jù)其序列同源性將鹵醇脫鹵酶分為A,B和C 3種亞型,它們之間的氨基酸序列同源性為20%～30%[7]。這3種亞型鹵醇脫鹵酶的底物范圍具有如下特性:A和B亞型鹵醇脫鹵酶對(duì)較長(zhǎng)鏈的鄰鹵醇(C5,C6)具有較高的催化活性,而C亞型鹵醇脫鹵酶則適用于催化短鏈鄰鹵醇(C2,C3)。此外,C亞型鹵醇脫鹵酶對(duì)脂肪族及芳香族均具有較高的立體選擇性,而A和B僅有較低的手性選擇性。因此人們對(duì)C亞型鹵醇脫鹵酶的研究更為深入,包括其穩(wěn)定性、催化機(jī)理、動(dòng)力學(xué)反應(yīng)機(jī)制、三級(jí)結(jié)構(gòu)及生物催化特性等。

2016年,Koopmeiners等[21]和Anett等[22]利用基因挖掘技術(shù)以HHDHs親核結(jié)合口袋結(jié)構(gòu)(T-X4-F/Y-X-G)和第2個(gè)催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)(SX12YX3R)的兩個(gè)序列挖掘到37種新型鹵醇脫鹵酶,并對(duì)其中17種酶的酶活及立體選擇性進(jìn)行了研究。通過研究其序列同源性,發(fā)現(xiàn)部分酶不能分配到A,B和C亞型,通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析增加了D,E,F和G 4種亞型。到目前為止,研究最多的是HheC,HheC催化1,3-二氯-2-丙醇生成環(huán)氧氯丙烷,底物的轉(zhuǎn)化率可達(dá)92.3%[23]。此外,它對(duì)2,3-二氯-1-丙醇、3-氯-1,2-丙二醇、2-氯-1-苯基乙醇、對(duì)硝基-2-溴-1-苯基乙醇等底物都具有較高的催化活性。當(dāng)HheC催化2,2-β-氰與疊氮雙取代環(huán)氧化物生成相應(yīng)的手性純環(huán)氧化物和β-取代叔醇(e.e.達(dá)99%)時(shí),如果甲基在手性中心作為第二取代基將極大增加反應(yīng)的立體選擇性(對(duì)映體選擇率E>200)[24]。

2 鹵醇脫鹵酶的分子改造

作為生物催化劑,酶具有優(yōu)異的區(qū)域選擇性與立體選擇性,在催化合成中日益受到重視。鹵醇脫鹵酶可以立體選擇性地催化合成手性環(huán)氧化物與手性鄰鹵醇,這些手性產(chǎn)物作為手性砌塊被廣泛應(yīng)用于精細(xì)化工和手性藥物的合成。野生型鹵醇脫鹵酶由于熱穩(wěn)定性不足以及立體選擇性不高等原因,不能滿足工業(yè)應(yīng)用的要求,因此需要對(duì)酶進(jìn)行分子改造,提高其催化特性,如立體選擇性、催化活性、熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑耐受性等。近幾年,國(guó)內(nèi)外研究者采用蛋白質(zhì)工程技術(shù)的定向進(jìn)化、半理性設(shè)計(jì)和理性設(shè)計(jì)等分子進(jìn)化手段對(duì)鹵醇脫鹵酶進(jìn)行分子改造。

表2 鹵醇脫鹵酶的分子進(jìn)化

目前為止,對(duì)鹵醇脫鹵酶HheC的改造研究最多,這主要是因?yàn)槿藗儗?duì)其晶體結(jié)構(gòu)及催化機(jī)理研究最深,為其理性設(shè)計(jì)提供了結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系基礎(chǔ)。通常人們對(duì)鹵醇脫鹵酶HheC的活性位點(diǎn)及底物結(jié)合口袋進(jìn)行改造,例如將底物結(jié)合口袋部位的氨基酸殘基轉(zhuǎn)化為較小的氨基酸以減小空間阻力,或?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為疏水基團(tuán)增加和底物的親和性,并且可以通過分子對(duì)接等手段對(duì)其進(jìn)行理論設(shè)計(jì)。例如,Wu等[27]采用大引物易錯(cuò)PCR方法和迭代定點(diǎn)飽和突變(ISM)方法對(duì)于鹵醇脫鹵酶HheC構(gòu)建突變文庫(kù),篩選到的最好突變體Var4在65 ℃條件下酶的半衰期提高3 400 倍,在75 ℃下溫育30 min后仍保留75%活性。Xue等[28]對(duì)鹵醇脫鹵酶HheC進(jìn)行理性設(shè)計(jì),通過定點(diǎn)突變,所獲得的突變體P175S/W249P在pH 8.0下催化1,3-二氯-2-丙醇生成S-環(huán)氧氯丙烷的立體選擇性從5%提高至95%,在pH 10下其e.e.為92.3%,產(chǎn)率達(dá)92.3%。如果再聯(lián)合環(huán)氧化物水解酶,其立體選擇性可達(dá)99%以上。除了采用現(xiàn)有的突變改造方法,Wang等[29]還創(chuàng)建了高效多位點(diǎn)進(jìn)化策略,利用該策略對(duì)鹵醇脫鹵酶HheC的碳末端的10個(gè)氨基酸進(jìn)行改造,篩選出的最優(yōu)突變體PX14半衰期是野生型的17.8倍,kcat是野生型的4倍。該策略不僅大大節(jié)約了篩選成本,還使得該酶的催化性能得到了提高。研究表明:在今后的研究中不僅要利用現(xiàn)有的改造策略,也需要根據(jù)具體的要求設(shè)計(jì)新的策略以提高改造效率。除了對(duì)鹵醇脫鹵酶HheC的改造,對(duì)其他鹵醇脫鹵酶如Mikleusevic等[30]進(jìn)行定點(diǎn)突變,將178位的天冬酰胺轉(zhuǎn)化成丙氨酸,可使得其對(duì)苯乙烯氧化衍生物和縮水甘油醚的立體選擇性提高。Liu等[31]對(duì)來自AgrobacteriumtumefaciensCCTCC M 87071的鹵醇脫鹵酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析,并進(jìn)行分子對(duì)接分析,對(duì)活性位點(diǎn)及底物結(jié)合口袋周圍的14個(gè)氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變,獲得的最優(yōu)突變體的催化活性比野生型增加26倍,kcat增加18.4倍,45 ℃下半衰期延長(zhǎng)3倍。

3 鹵醇脫鹵酶固定化

游離酶在使用時(shí)不易回收,難以重復(fù)利用,另外還會(huì)對(duì)后續(xù)產(chǎn)物分離造成影響,同時(shí)游離酶也可能對(duì)高溫、酸堿、離子強(qiáng)度以及有機(jī)溶劑等耐受性較差,這些缺陷共同限制了其在工業(yè)上的大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。鹵醇脫鹵酶在使用中也存在這些問題。酶的固定化技術(shù)是解決上述問題的有效途徑之一。通過采用酶固定化技術(shù),可使酶具有更高的穩(wěn)定性和可重復(fù)利用性,具有可操作連續(xù)、工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),成為近年來酶工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[33-35]。

對(duì)酶固定化技術(shù)的研究具有悠久的歷史,而對(duì)鹵醇脫鹵酶固定化的研究是近幾年才開始的。酶固定化技術(shù)中最重要的是載體選擇及固定方法。為了達(dá)到不同的目的,人們往往會(huì)根據(jù)酶的特性及實(shí)際應(yīng)用環(huán)境,選擇不同的載體及固定化方法。鹵醇脫鹵酶表面有許多疏水基團(tuán),表面疏水性高,故常采用環(huán)氧樹脂作為固定化載體。由于環(huán)氧基團(tuán)在常溫下即可與酶蛋白表面的活性官能團(tuán)如氨基、羧基、巰基等產(chǎn)生溫和的開環(huán)共價(jià)結(jié)合,從而將酶分子固定在載體表面。合成樹脂載體在較長(zhǎng)的使用周期內(nèi)具有很強(qiáng)的耐微生物和酸堿腐蝕性以及較強(qiáng)的機(jī)械性能,因此當(dāng)前對(duì)鹵醇脫鹵酶固定化的研究主要是以合成樹脂為載體,采用共價(jià)結(jié)合法進(jìn)行固定。該方法固定的鹵醇脫鹵酶具有良好的操作穩(wěn)定性,可重復(fù)利用。2016年,顧愷等[36]將鹵醇脫鹵酶共價(jià)結(jié)合在環(huán)氧樹脂ES-103B上,利用低鹽吸附和添加甘油作為酶活中心保護(hù)劑,在最佳固定條件下酶活的回收率為74.5%,酶固定化效率為94.2%,比活力為518.6 U/g。在催化1,3-二氯丙醇制備環(huán)氧氯丙烷的反應(yīng)中,重復(fù)使用15次后,反應(yīng)的產(chǎn)物收率還可達(dá)到初始收率的91%以上。2018年,Zhang等[37]采用A502Ps樹脂固定化鹵醇脫鹵酶HheC(P175S/W249P)制備S-環(huán)氯丙烷,1,3-二氯丙醇的濃度為20 mmol/L時(shí),S-環(huán)氧氯丙烷的產(chǎn)率為83.78%,e.e.為92.53%。共價(jià)結(jié)合固定方法是利用化學(xué)方法對(duì)酶進(jìn)行固定。該固定方法所獲得的固定化酶雖然穩(wěn)定性高、重復(fù)利用率高,但是固定過程中酶活力損失大。為了避免固定化過程中酶活的損失,利用凝膠、半透膜等材料包埋是一種較好的選擇。梁國(guó)斌等[38]利用海藻酸鈣凝膠包埋鹵醇脫鹵酶,利用戊二醛進(jìn)一步交聯(lián),制定出固定化脫鹵酶微球,催化制備R-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯(ATS-5)。在最佳條件下,利用固定化酶微球合成ATS-5,在連續(xù)運(yùn)行10 h后反應(yīng)轉(zhuǎn)化率可以保持90.6%,ATS-5分離收率達(dá)到98.2%,純度達(dá)到99.3%,光學(xué)純度達(dá)到99.1%。該固定化酶在4 ℃下保存80 d,無明顯的酶活下降。除了常見的固定化方法,還有無載體的交聯(lián)酶聚集體(CLEAs)固定化技術(shù)。2014年,Dvorak等[39]采用該固定化方法,將來自RhodococcusrhodochrousNCIMB 13064的工程化鹵代烷脫鹵酶、來自AgrobacteriumradiobacterAD1的鹵醇脫鹵酶與環(huán)氧化物水解酶,以純酶或無細(xì)胞提取物的形式進(jìn)行固定制備CLEAs,使用該固定的酶在填充床反應(yīng)器內(nèi)連續(xù)降解1,2,3-三氯丙烷(TCP)污染物,反應(yīng)穩(wěn)定運(yùn)行75 d,可以將52.6 mmol/L的TCP連續(xù)轉(zhuǎn)化為甘油,TCP轉(zhuǎn)化率為97%,產(chǎn)物甘油的收率為78%。

4 結(jié) 論

鹵醇脫鹵酶已顯現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景,開發(fā)活性更高、酶學(xué)性能更好的新型酶是鹵醇脫鹵酶研究的熱點(diǎn)方向之一。隨著宏基因技術(shù)、基因挖掘技術(shù)等的發(fā)展,越來越多新型鹵醇脫鹵酶被發(fā)掘出來,但是很多野生型鹵醇脫鹵酶因?yàn)槊富钶^低、立體選擇性不高和穩(wěn)定性差等缺點(diǎn),限制了其在工業(yè)中的應(yīng)用。為解決這一問題,利用定向進(jìn)化、半理性設(shè)計(jì)和理性設(shè)計(jì)等方法對(duì)已有鹵醇脫鹵酶進(jìn)行分子改造是鹵醇脫鹵酶研究的另一熱點(diǎn)。采用固定化方法可提高酶的穩(wěn)定性和重復(fù)利用率,促進(jìn)鹵醇脫鹵酶的工業(yè)利用。因此,功能性的鹵醇脫鹵酶新型固定化載體開發(fā)也是將來鹵醇脫鹵酶研究的方向之一。此外,還應(yīng)加強(qiáng)在以下幾個(gè)方面的研究:1)深入解析鹵醇脫鹵酶的結(jié)構(gòu),構(gòu)建其結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系,以此指導(dǎo)鹵醇脫鹵酶的進(jìn)化與改造;2)注重對(duì)已有的鹵醇脫鹵酶新反應(yīng)的開發(fā),拓寬其催化應(yīng)用領(lǐng)域;3)結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)特點(diǎn),根據(jù)鹵醇脫鹵酶的催化特性開發(fā)高效的反應(yīng)器,研究其過程工藝技術(shù)。這些工作的開展將極大地推動(dòng)鹵醇脫鹵酶的研究及其應(yīng)用。