王斯斯 綜述 管 娜 審校

局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)是導(dǎo)致終末期腎病的常見腎小球疾病,主要表現(xiàn)為激素耐藥型腎病綜合征(NS),治療困難,治療藥物有限,亟待探討新的治療藥物[1-3]。近年研究證實(shí),哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mTORC1)通路過度活化可介導(dǎo)FSGS足細(xì)胞損傷機(jī)制,雷帕霉素(RAPA)及其衍生物如依維莫司可通過抑制過度活化的mTORC1保護(hù)足細(xì)胞,理論上有治療FSGS的應(yīng)用前景,本文對相關(guān)研究進(jìn)展加以綜述[4]。

mTORC1概述

mTORC1是由哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、哺乳類致死SEC13蛋白8(mLST8)、mTOR調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白(Raptor)、富含脯氨酸的Akt底物和包含DEP域的與mTOR相互作用的蛋白等組成的復(fù)合物[5]。mTOR是289 kDa的蛋白激酶,屬于磷脂酰肌醇3-激酶相關(guān)激酶家族成員,是mTORC1中最重要的功能蛋白。mTOR起到分子感受器的作用,在多種信號刺激下,mTOR通過磷酸化下游底物核糖體蛋白S6磷酸激酶1(S6K1)和4E結(jié)合蛋白1(4E-BP 1)調(diào)控與細(xì)胞生長、增殖、代謝和死亡相關(guān)的關(guān)鍵蛋白的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成。mTORC1主要受磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)調(diào)控,受結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物1/結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物2(Tsc1/Tsc2)抑制[6]。mTORC1參與調(diào)控蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)和其他大分子的生成,抑制分解代謝過程,如自噬和溶酶體生成,是調(diào)控細(xì)胞生長、增殖、代謝和死亡的核心機(jī)制(圖1)[5]。

圖1 mTORC1信號通路及功能PI3K：磷脂酰肌醇-3-激酶；Akt：蛋白激酶B；AMPK：腺苷酸活化蛋白激酶；mTORC1：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1；4E-BP：4E結(jié)合蛋白；S6K1：核糖體蛋白S6激酶1；ULK：unc-51類自噬激活激酶；SREBP：固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白；PGC-1α：過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α

mTORC1與足細(xì)胞損傷

mTORC1的適度活化是維持足細(xì)胞正常形態(tài)的必要條件。足細(xì)胞特異性Raptor敲除(RaptorΔpodocyte)小鼠足細(xì)胞mTORC1活化標(biāo)記物pS6減少,足突融合[7]。mTORC1可通過抑制自噬維持足細(xì)胞基礎(chǔ)自噬功能;調(diào)控WT1表達(dá)影響足細(xì)胞完整性;調(diào)控足細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)生成影響腎小球?yàn)V過屏障功能;調(diào)控丙酮酸激酶M2影響足細(xì)胞分化,調(diào)控足細(xì)胞裂孔隔膜分子nephrin、瞬時受體電位陽離子通道蛋白6和細(xì)胞骨架接頭蛋白Nck表達(dá),影響足細(xì)胞細(xì)胞黏附性和遷移[8-11]。

mTORC1過度活化參與FSGS發(fā)病機(jī)制。在阿霉素(ADR)誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞損傷模型、ADR小鼠腎病模型和FSGS患者均觀察到mTORC1過度活化現(xiàn)象[4,12]。來自基因敲除模型進(jìn)一步證實(shí),特異性敲除足細(xì)胞mTORC1負(fù)性調(diào)節(jié)因子Tsc1使mTORC1過度活化確實(shí)可致小鼠出現(xiàn)FSGS病變和蛋白尿[4,12-13]。

目前尚缺乏足細(xì)胞系對mTORC1過度活化引起的下游機(jī)制的研究。在小鼠模型中,mTORC1過度活化導(dǎo)致足細(xì)胞數(shù)量減少、足細(xì)胞脫落、足細(xì)胞肥大、足突融合、裂孔隔膜分子nephrin表達(dá)量正常但不能正常定位至裂孔隔膜部位、足細(xì)胞向成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換等,其中足細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換被認(rèn)為與足細(xì)胞脫落有關(guān)[4,12-13]。

動物模型研究顯示RAPA及其衍生物可顯著減輕蛋白尿和FSGS。預(yù)防性應(yīng)用RAPA或ADR注射后1～2周出現(xiàn)蛋白尿時治療性應(yīng)用RAPA均顯著改善了ADR小鼠腎病模型蛋白尿及腎小球硬化[4,14]。在ADR大鼠腎病模型中,預(yù)防性或治療性應(yīng)用依維莫司均顯著改善了蛋白尿[15]。在mTORC1過度活化所致小鼠腎病模型中,RAPA顯著改善足細(xì)胞功能分子nephrin的分布、足突融合和蛋白尿[13]。在ADR小鼠腎病模型中,敲除一個Raptor等位基因可抑制過度活化的mTORC1,改善腎小球硬化和蛋白尿[4]。上述證據(jù)表明抑制過度活化的mTORC1可能成為新的足細(xì)胞保護(hù)靶點(diǎn)(圖2)。

圖2 mTORC1過度活化與足細(xì)胞損傷和FSGSTGF-β:轉(zhuǎn)化生長因子-β;Tsc1:結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物1;mTORC1:哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1;pS6:磷酸化核糖體蛋白S6;4E-BP:4E結(jié)合蛋白;FSGS:局灶節(jié)段性腎小球硬化;RAPA:雷帕霉素；ULK1：unc-51類自噬激活激酶1

RAPA及其衍生物在FSGS的臨床研究現(xiàn)狀

RAPA于1964年被發(fā)現(xiàn),之后其衍生物如依維莫司和坦西莫司等陸續(xù)被研發(fā)[5]。此類藥物與FK506結(jié)合蛋白12結(jié)合后作用于mTOR激酶的FRB結(jié)構(gòu)域,阻止mTOR激酶與特異性底物結(jié)合從而抑制mTORC1活性[16-18]。由于只有mTORC1復(fù)合物的FRB結(jié)構(gòu)域可與RAPA及其衍生物結(jié)合,因此RAPA及其衍生物主要是mTORC1抑制劑。由于具有免疫抑制作用,RAPA于1999年被美國食品藥品管理總局批準(zhǔn)臨床上用于器官移植患者[19],目前也被用于腎臟腫瘤和多囊腎患者[16-18]。

迄今主要有4篇研究(3篇成人和1篇兒童)報道了RAPA用于治療激素耐藥型NS或FSGS,結(jié)果不一(表1)[20-23]。Tumlin等[20]報道了RAPA治療21例成人激素耐藥型FSGS患者的前瞻性開放標(biāo)簽臨床試驗(yàn),治療6個月后緩解率為57%。1例治療前腎皮質(zhì)間質(zhì)纖維化達(dá)70%者治療期間出現(xiàn)腎功能進(jìn)行性下降。Tsagalis等[21]報道甲潑尼龍聯(lián)合RAPA治療3例成人原發(fā)性FSGS患者,治療后均獲緩解,腎功能未受影響。Liern等[22]報道RAPA治療13例表現(xiàn)為激素耐藥型NS且鈣調(diào)磷酸酶抑制劑、環(huán)磷酰胺以及依那普利或氯沙坦治療無效的原發(fā)性FSGS患兒,療程 12個月,69%達(dá)完全或部分緩解。觀察到的RAPA主要不良反應(yīng)為高脂血癥、貧血、口腔潰瘍和胃腸道反應(yīng)等。上述研究為RAPA進(jìn)一步用于FSGS的治療提供了臨床證據(jù)。

然而,1項(xiàng)RAPA治療FSGS患者的2期開放標(biāo)簽臨床試驗(yàn)顯示RAPA可加重一些患者病情[23]。該研究納入了6例原發(fā)性FSGS成人患者,經(jīng)8.0±3.0個月治療后6例蛋白尿均未緩解,5例在用藥后1～5個月出現(xiàn)腎功能下降,2例停用RAPA后2～7天腎功能恢復(fù)。其中2例因治療后腎功能下降行腎活檢發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的間質(zhì)纖維化、腎小管萎縮和急性腎小管壞死。由于患者在用RAPA前未行腎臟病理檢查,不能排除所發(fā)現(xiàn)腎臟病理改變與FSGS進(jìn)展有關(guān)。此外,來自其他疾病的研究也報道了RAPA的腎臟不良反應(yīng),限制了其在FSGS的進(jìn)一步應(yīng)用。

RAPA的不良反應(yīng)及機(jī)制

蛋白尿來自腎移植患者的研究報道蛋白尿是RAPA主要不良反應(yīng)之一,被認(rèn)為與高劑量應(yīng)用RAPA有關(guān)。Loriga等[24]報道高劑量依維莫司與蛋白尿顯著相關(guān)。Letavernier等[25]報道3例腎移植患者用高劑量RAPA(血藥濃度15.8～17.1 ng/L)后出現(xiàn)NS和FSGS。RAPA相關(guān)蛋白尿主要是腎小球性蛋白尿。RAPA也抑制腎小管上皮細(xì)胞對白蛋白的重吸收,下調(diào)cubilin和megalin表達(dá),該作用可被ACEI逆轉(zhuǎn)[26]。RAPA相關(guān)腎小球性蛋白尿的機(jī)制被認(rèn)為與抑制VEGF表達(dá)、裂孔隔膜分子表達(dá)和足細(xì)胞線粒體腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)合成以及治療時機(jī)的選擇有關(guān)。

過度抑制mTOR活性mTOR維持適度活化是足細(xì)胞維持正常功能的前提?；蚯贸Ｐ妥C實(shí),僅部分抑制過度活化的mTOR具有足細(xì)胞保護(hù)作用,而完全抑制mTOR活性可導(dǎo)致足細(xì)胞損傷和蛋白尿[4]。

抑制VEGF VEGF對足細(xì)胞生存和分化有重要作用。Letavernier 等[25]發(fā)現(xiàn),在RAPA誘發(fā)的FSGS病變中,VEGF局灶性表達(dá)缺失。培養(yǎng)的人足細(xì)胞用治療濃度的RAPA處理后,VEGF合成和蛋白激酶B磷酸化顯著降低,發(fā)生細(xì)胞骨架重排和細(xì)胞表型變化[9]。RAPA抑制VEGF信號通路導(dǎo)致足細(xì)胞VEGF通路紊亂被認(rèn)為與蛋白尿有關(guān)。

抑制足細(xì)胞及裂孔隔膜分子表達(dá)Stallone等[27]分析了110例應(yīng)用RAPA的腎移植患者,根據(jù)用藥后2年內(nèi)尿蛋白情況將患者分為尿蛋白增多>70%和<70%組,結(jié)果發(fā)現(xiàn)尿蛋白增多>70%組足細(xì)胞裂孔隔膜分子nephrin和podocin顯著減少,與RAPA高血藥濃度顯著相關(guān)。體外研究發(fā)現(xiàn),足細(xì)胞分子WT1及裂孔隔膜關(guān)鍵分子nephrin、podocin和CD2ap表達(dá)與RAPA劑量有關(guān),大劑量應(yīng)用RAPA及其衍生物導(dǎo)致WT1和裂孔隔膜分子表達(dá)減少,破壞足細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性[9,27]。然而,關(guān)于上述分子在RAPA腎臟不良反應(yīng)中的作用也有不同的觀點(diǎn)。Kim等[28]用高低不同劑量RAPA作用于C57BL/6小鼠,盡管觀察到RAPA導(dǎo)致足細(xì)胞相關(guān)分子WT1、synaptopodin和nephrin等表達(dá)顯著下調(diào),但未導(dǎo)致蛋白尿,提出RAPA對上述足細(xì)胞分子的抑制作用不足以誘發(fā)蛋白尿。

抑制足細(xì)胞線粒體ATP合成Zschiedrich等[4]發(fā)現(xiàn)低劑量mTOR抑制劑不影響足細(xì)胞線粒體ATP合成,可減輕ADR誘導(dǎo)的足細(xì)胞線粒體功能障礙,而高劑量mTOR抑制劑顯著抑制了足細(xì)胞線粒體ATP合成,加重了ADR誘導(dǎo)的足細(xì)胞線粒體功能障礙,提示對線粒體功能影響不同可能介導(dǎo)了mTOR抑制劑產(chǎn)生的不同足細(xì)胞和蛋白尿效應(yīng)。

自噬障礙mTORC1為負(fù)性自噬調(diào)節(jié)因子。RAPA可抑制mTORC1使足細(xì)胞自噬增強(qiáng)和自噬溶酶體再循環(huán)障礙,自噬體和自噬溶酶體堆積,從而導(dǎo)致自噬循環(huán)障礙,受損線粒體清除障礙。mTOR過度抑制小鼠表現(xiàn)為蛋白尿、足細(xì)胞空泡變性和腎小球硬化改變,電鏡下可見足細(xì)胞自噬體和自噬溶酶體增多[29]。

治療時機(jī)的選擇基因敲除模型研究顯示,在疾病早期mTORC1過度活化可導(dǎo)致足細(xì)胞肥大。有學(xué)者認(rèn)為,關(guān)于RAPA的應(yīng)用存在治療窗。在疾病早期足細(xì)胞肥大有代償意義,此時予以RAPA類藥物可能與腎損害有關(guān)。若足細(xì)胞mTORC1持續(xù)過度活化,可導(dǎo)致足細(xì)胞不可逆的損傷及表型轉(zhuǎn)換,可能更適合RAPA類藥物應(yīng)用[4]。然而,目前尚缺乏用于評估患者RAPA類藥物治療時機(jī)的客觀評價指標(biāo)。

腎功能下降高劑量RAPA類藥物與腎功能下降有關(guān)。Kim等[28]在小鼠實(shí)驗(yàn)中證實(shí)低劑量(3 mg/kg)RAPA對血清肌酐無影響,高劑量(10 mg/kg,30 mg/kg)RAPA導(dǎo)致血清肌酐顯著增高。加重鈣調(diào)磷酸酶抑制劑(CNIs)腎毒性、誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和腎間質(zhì)纖維化等機(jī)制被認(rèn)為參與RAPA不良反應(yīng)。

與CNIs有關(guān)臨床觀察到RAPA類藥物與CNIs聯(lián)用時似乎更易出現(xiàn)腎損害,可能與RAPA及其衍生物加重CNIs腎毒性有關(guān)[30]。Cho等[23]報道3例用RAPA后出現(xiàn)腎功能快速下降患者中2例在RAPA治療前曾用環(huán)孢素A治療約3年。

腎小管上皮細(xì)胞損傷及腎間質(zhì)纖維化RAPA可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡[31]。高劑量依維莫司可誘導(dǎo)人近端腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化,α平滑肌肌動蛋白、波形蛋白、纖維連接蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)增多,而低劑量依維莫司無此作用[32]。Tumlin等[20]報道,1例RAPA治療后腎功能迅速下降者在治療前有嚴(yán)重的腎間質(zhì)纖維化,提示間質(zhì)纖維化程度可能與用RAPA后腎功能下降有關(guān)。

小結(jié):RAPA及其衍生物理論上可通過抑制過度活化的mTORC1保護(hù)足細(xì)胞治療FSGS,然而現(xiàn)有臨床結(jié)果不一,呈現(xiàn)有效、無效、甚至用藥后出現(xiàn)蛋白尿或腎功能下降等表現(xiàn),限制了RAPA在臨床的應(yīng)用。對RAPA效應(yīng)機(jī)制及腎臟不良反應(yīng)機(jī)制的深入研究有助于為臨床篩選可能受益于RAPA及其衍生物治療的患者類型以及指導(dǎo)用藥提供理論參考。