李溪玥 吳 丹 綜述 曾彩虹 審校

膽固醇結(jié)晶相關(guān)腎損害包括膽固醇結(jié)晶栓塞性腎病和腎小管間質(zhì)膽固醇結(jié)晶相關(guān)損害。動(dòng)脈粥樣硬化病變?cè)缙?，膽固醇在?dòng)脈內(nèi)皮下的積聚導(dǎo)致泡沫細(xì)胞的形成，過(guò)量的膽固醇在細(xì)胞中積聚可形成膽固醇結(jié)晶。膽固醇結(jié)晶的形成是晚期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的特征。覆蓋斑塊的纖維帽破裂后，斑塊內(nèi)的膽固醇結(jié)晶暴露在血液循環(huán)中，導(dǎo)致小動(dòng)脈管腔狹窄或閉塞并激活炎相關(guān)癥因子引發(fā)局部和全身炎癥反應(yīng)。病變可累及腎臟、皮膚、胃腸道、眼睛、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等，腎臟是膽固醇結(jié)晶栓塞的常見(jiàn)靶器官。腎小管膽固醇晶體和腎間質(zhì)膽固醇肉芽腫也并不少見(jiàn)，但具體機(jī)制尚缺乏深入研究。本文擬簡(jiǎn)介膽固醇在細(xì)胞內(nèi)代謝過(guò)程，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)膽固醇結(jié)晶形成原因，膽固醇結(jié)晶誘導(dǎo)炎癥的細(xì)胞和分子機(jī)制和其對(duì)腎臟損害的表現(xiàn)。

細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝

膽固醇是哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜的重要脂質(zhì)成分，可維持膜的完整性和流動(dòng)性，脂質(zhì)筏是富含膽固醇和鞘磷脂的一種特殊膜結(jié)構(gòu)，膜流動(dòng)性更低。膽固醇的合成、攝取、外排、轉(zhuǎn)化、酯化和運(yùn)輸由復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)維持。細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量主要受羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA)活性和細(xì)胞從循環(huán)中攝取脂質(zhì)速率的影響。HMG-CoA是膽固醇合成的限速酶，胞內(nèi)膽固醇過(guò)載時(shí)該酶則受到抑制。膽固醇在血漿中主要以與極低密度脂蛋白(VLDL)及低密度脂蛋白(LDL)結(jié)合成膽固醇酯(ESC)的形式存在。膽固醇酯與細(xì)胞膜上的LDL受體(LDLR)、清道夫受體B族I型(SR-BI)、和CD36等受體結(jié)合后內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)溶酶體酶解后，上述受體返回細(xì)胞膜，而ESC進(jìn)一步水解為游離膽固醇(FC)滯留在細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)FC濃度過(guò)高時(shí)，可通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制降低上述受體的合成以維持細(xì)胞內(nèi)正常的膽固醇濃度[1]。膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)即荷脂細(xì)胞將膽固醇分泌至細(xì)胞外的過(guò)程，涉及的主要因子有高密度脂蛋白(HDL)、載脂蛋白AI(ApoAⅠ)、凹陷蛋白、腺苷三磷酸結(jié)合元件A1(ATP binding cassette A1,ABCA1)和SR-BI等。ABCA1是介導(dǎo)膽固醇流出的最重要膜調(diào)控蛋白，可引起細(xì)胞表面脂筏的破壞，使細(xì)胞表面相關(guān)受體的聚集受到影響，易化炎癥信號(hào)傳導(dǎo)。HDL可促進(jìn)過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPAR-γ)的磷酸化，從而提高ABCA1的表達(dá)進(jìn)而降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量。

動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的膽固醇結(jié)晶形成

動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的脂質(zhì)主要由膽固醇、磷脂以及少量的三酰甘油和脂肪酸組成，膽固醇本身具有形成結(jié)晶的特性，當(dāng)溶液中的濃度超過(guò)其溶解度，則以水化合物的形式析出形成結(jié)晶，體積膨脹。膽固醇的量越多，體積膨脹得越大[2]，而斑塊纖維帽則相應(yīng)變薄，當(dāng)纖維帽厚度<65 μm時(shí)斑塊可能破裂[3]。斑塊的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)演變過(guò)程，在脂肪條紋向纖維斑塊轉(zhuǎn)變期間，膽固醇結(jié)晶開(kāi)始形成[4]，膽固醇結(jié)晶可在斑塊壞死核心、內(nèi)皮下及巨噬細(xì)胞內(nèi)外出現(xiàn)。?；o酶A-膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(ACAT)催化FC和長(zhǎng)鏈脂肪酸合成ESC，將FC轉(zhuǎn)化為酯化狀態(tài)，LDL顆粒中的膽固醇以酯化形式存在。斑塊的形成始于膽固醇與LDL顆粒結(jié)合進(jìn)入動(dòng)脈壁內(nèi)觸發(fā)免疫反應(yīng)，募集巨噬細(xì)胞到該區(qū)域，并大量攝取酯化膽固醇形成泡沫細(xì)胞。ESC在膽固醇酯水解酶(CEH)的作用下水解為FC，F(xiàn)C在動(dòng)脈壁內(nèi)積聚易形成膽固醇結(jié)晶[5]。酯化和反酯化平衡的破壞會(huì)導(dǎo)致泡沫細(xì)胞中的ESC/FC的積累。動(dòng)脈粥樣硬化早期，膽固醇結(jié)晶還可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮鈣黏蛋白和α連環(huán)蛋白酪氨酸磷酸化增強(qiáng)，從而破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞間黏附連接并增加血管通透性。消退素D1(resolvin D1,RvD1)作為一種特異性促炎癥消退介質(zhì)，可以保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能不受膽固醇結(jié)晶破壞[5]。KellnerWeibel等[6]證實(shí)抑制ACAT可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞質(zhì)膜雙層中膽固醇一水合物晶體的形成。

膽固醇結(jié)晶誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞分子機(jī)制

巨噬細(xì)胞表達(dá)多種細(xì)胞表面受體如C型凝集素受體(CLR)等以識(shí)別和內(nèi)化致病性顆粒。CLR是一種新發(fā)現(xiàn)的模式識(shí)別受體家族，可識(shí)別病原體啟動(dòng)先天性免疫應(yīng)答。人巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)型C型凝集素受體(hMincle)是在活化的巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞上表達(dá)的CLR。Kiyotake等[7]研究證實(shí)hMincle有一個(gè)膽固醇識(shí)別氨基酸序列(CRAC)，通過(guò)該序列，膽固醇結(jié)晶與巨噬細(xì)胞表面的hMincle結(jié)合，從而引發(fā)先天免疫反應(yīng)。hMincle通過(guò)與FcRγ鏈[一種基于免疫受體酪氨酸激活序列(ITAM)的接頭蛋白]偶聯(lián)以激活免疫細(xì)胞。有研究證明巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞內(nèi)膽固醇晶體可激活Nod樣受體蛋白3(NLRP3)[30]。

補(bǔ)體通過(guò)感知危險(xiǎn)、傳遞危險(xiǎn)信號(hào)及觸發(fā)細(xì)胞碎片的清除，在體內(nèi)平衡中發(fā)揮重要作用。膽固醇結(jié)晶可被補(bǔ)體系統(tǒng)的凝集素途徑和經(jīng)典途徑識(shí)別，從而激活C3和C5并釋放炎性介質(zhì)C5a片段。補(bǔ)體被膽固醇結(jié)晶激活后，與NLRP3炎癥小體-caspase-1信號(hào)通路產(chǎn)生串?dāng)_并產(chǎn)生白細(xì)胞介素1β(IL-1β)。體外實(shí)驗(yàn)表明,膽固醇結(jié)晶可通過(guò)與甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)和纖維膠凝蛋白2(ficolin-2)結(jié)合激活凝集素途徑，從而導(dǎo)致補(bǔ)體激活產(chǎn)物的沉積[8-9]。在膽固醇結(jié)晶誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活過(guò)程中，凝集素途徑和經(jīng)典途徑有協(xié)同作用。膽固醇結(jié)晶對(duì)補(bǔ)體的強(qiáng)大激活潛能可將免疫細(xì)胞招募到斑塊中促進(jìn)膽固醇結(jié)晶形成，從而導(dǎo)致局部炎癥。補(bǔ)體在細(xì)胞碎片和巨噬細(xì)胞聚集的區(qū)域與膽固醇結(jié)晶結(jié)合，吸引更多的免疫細(xì)胞進(jìn)入膽固醇結(jié)晶[10]。膽固醇結(jié)晶啟動(dòng)補(bǔ)體激活途徑后可釋放促炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)和IL-1β。在人類全血模型中C5aR1拮抗劑對(duì)膽固醇結(jié)晶誘導(dǎo)的TNF和IL-1β有很強(qiáng)的抑制作用[11]，由此可見(jiàn)C5a在這一反應(yīng)中起主要作用。

嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞具有共同的造血祖先髓樣細(xì)胞，它們具有共同和獨(dú)特的免疫功能。當(dāng)組織損傷或感染時(shí)，中性粒細(xì)胞首先浸潤(rùn)，隨后是單核細(xì)胞。Brinkmann等[12]在2004年發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞壞死或者凋亡后，可釋放一種網(wǎng)狀物質(zhì)來(lái)捕獲、殺滅細(xì)菌，他們將其命名為中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular trap，NET)[12],這一過(guò)程命名為NET凋零[12]。NET包含DNA、組蛋白、嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和髓過(guò)氧化物酶。晶體顆粒以受體相互作用蛋白1-受體相互作用蛋白3-混合系激酶區(qū)域樣蛋白(RIPK1-RIPK3-MLKL)依賴的方式觸發(fā)中性粒細(xì)胞壞死進(jìn)而釋放NET[13]。Warnatsch等[14]證明,細(xì)胞外膽固醇晶體與中性粒細(xì)胞相互作用觸發(fā)NETs的釋放，引發(fā)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子IL-1β的前體(pro-IL-1β)。除了激活NETosis外，與巨噬細(xì)胞表面CD36蛋白結(jié)合的膽固醇可通過(guò)內(nèi)吞作用被內(nèi)化并激活炎癥小體信號(hào)復(fù)合物。炎癥小體通過(guò)caspase-1裂解pro-IL-1β促進(jìn)IL-1β的成熟并釋放到胞外發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[14]。

NLRP3炎癥小體是由NLRP3亞基、與凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC)和無(wú)活性的caspase-1前體組成的蛋白復(fù)合物。NLRP3亞基由亮氨酸富集結(jié)構(gòu)域(LRR)、Nod結(jié)構(gòu)域和熱結(jié)構(gòu)域(PYD) 或caspase募集結(jié)構(gòu)域(CARD)組成，可識(shí)別配體、介導(dǎo)自身聚集反應(yīng)及轉(zhuǎn)導(dǎo)下游信號(hào)。在受到刺激時(shí)，NLRP3炎癥小體通過(guò)NLRP3-ASC-caspase-1-IL-1β/IL-18 軸的逐級(jí)活化在炎癥免疫性疾病過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。目前研究表明有多種不同的炎癥小體激活機(jī)制，包括鉀外排、鈣內(nèi)流、線粒體功能障礙、線粒體活性氧的產(chǎn)生、線粒體DNA或心磷脂的釋放、溶酶體的不穩(wěn)定和破裂[15]。已證明NLRP3炎癥小體對(duì)膽固醇結(jié)晶等刺激有應(yīng)答。NLRP3炎癥小體發(fā)揮作用需要雙重信號(hào)的刺激，第一信號(hào)為預(yù)刺激信號(hào)，通過(guò)活化MAPK和核因子κB(NF-κB)信號(hào)途徑而上調(diào)NLRP3和 IL-1β、IL-18 前體的表達(dá)；第二信號(hào)又稱活化信號(hào)，NLR的寡聚化及變構(gòu)進(jìn)而募集 ASC，活化 caspase-1促使pro-IL-1β活化為IL-1β并釋放[16]。IL-1β是一種強(qiáng)有力的促炎細(xì)胞因子，是動(dòng)脈粥樣硬化的主要致病細(xì)胞因子，并與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)[17]。IL-1β通過(guò)減少ABCA1的表達(dá)抑制膽固醇向細(xì)胞外流出,從而提高細(xì)胞內(nèi)膽固醇的濃度。在NLRP3基因敲除的糖尿病腎病小鼠模型研究中，敲除鼠的腎小管上皮細(xì)胞的空泡變性輕于對(duì)照組，提示NLRP3可增加細(xì)胞脂質(zhì)負(fù)載[18]。有研究表明，被吞噬的顆粒導(dǎo)致溶酶體膜破裂后可引起NLRP3激活和細(xì)胞死亡[19-20]。針對(duì)組織蛋白酶b的特異性抑制劑可抑制NLRP3活化所致的細(xì)胞死亡和IL-1β分泌[21-23]。目前還發(fā)現(xiàn)了多種組織蛋白參與IL-1β產(chǎn)生，并促進(jìn)pro-IL-1β的合成和NLRP3依賴的pro-IL-1β的活化[24]。

動(dòng)脈粥樣斑塊破裂后，針對(duì)動(dòng)脈內(nèi)膜損傷，淋巴細(xì)胞局部反應(yīng)性產(chǎn)生IL-6，IL-6循環(huán)到肝臟啟動(dòng)超敏C反應(yīng)蛋白的合成，從而導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)[25]，可出現(xiàn)貧血、血小板減少、白細(xì)胞增多、紅細(xì)胞沉降率高、 C反應(yīng)蛋白水平升高、低補(bǔ)體血癥等。

膽固醇結(jié)晶栓塞性腎病

主動(dòng)脈或其他大動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣斑塊破裂后，膽固醇結(jié)晶暴露于血液循環(huán)中并向下游血管床沖淋，引起動(dòng)脈遠(yuǎn)端栓塞即稱為膽固醇晶體栓塞或稱動(dòng)脈粥樣硬化栓塞，導(dǎo)致遠(yuǎn)端組織的缺血和梗死。膽固醇晶體栓塞可能自發(fā)，但通常由動(dòng)脈造影或血管內(nèi)手術(shù)操作引起的醫(yī)源性誘因所致。膽固醇晶體栓塞作為一種多系統(tǒng)疾病，可累及腎臟、皮膚、胃腸道、眼睛、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多臟器，腎臟血流動(dòng)力學(xué)的特性使其成為最易受累的器官。膽固醇結(jié)晶常阻塞弓形動(dòng)脈和葉間動(dòng)脈，從而導(dǎo)致整個(gè)腎單位的皮質(zhì)區(qū)域缺血，造成腎損傷、腎功能下降，出現(xiàn)膽固醇晶體栓塞性腎病。膽固醇結(jié)晶栓塞性腎病臨床表現(xiàn)分為急性、亞急性和慢性。急性、亞急性形式表現(xiàn)為腎功能突然下降，由不穩(wěn)定斑塊突然破裂后大量膽固醇晶體栓子堵塞到腎小動(dòng)脈所致。慢性膽固醇結(jié)晶栓塞性腎病臨床起病緩慢，與破裂的斑塊內(nèi)膽固醇晶體頻繁而緩慢的遷移有關(guān)。當(dāng)腎臟發(fā)生小的膽固醇晶體栓塞時(shí)，患者可不出現(xiàn)臨床癥狀。慢性膽固醇晶體栓塞性腎病與其他慢性腎臟疾病(如慢性腎小球硬化、高血壓性腎硬化)的癥狀相似，僅依據(jù)臨床鑒別診斷較為困難，需腎活檢進(jìn)一步明確。皮膚表現(xiàn)是膽固醇結(jié)晶栓塞最常見(jiàn)的臨床癥狀，如網(wǎng)狀青斑、壞疽、藍(lán)腳趾綜合癥等。當(dāng)出現(xiàn)特征性的藍(lán)腳趾綜合癥時(shí)，臨床上需考慮可能累及腎臟損傷。

腎小管間質(zhì)與膽固醇結(jié)晶

細(xì)胞膜的流動(dòng)性主要由膜磷脂和膽固醇構(gòu)建。在培養(yǎng)皿中，晶體可在細(xì)胞間緊密連接破壞后附著于腎小管上皮細(xì)胞，提示正常細(xì)胞膜的極性喪失可能是晶體-膜相互作用所需的條件[26]。Hirose等[27]最近研究草酸鈣晶體形成早期腎小管細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化，因氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化，使線粒體表現(xiàn)為空泡化、脂質(zhì)變化和鈣化，隨后可在腎小管管腔中觀察到晶核形成。人腎小管上皮細(xì)胞株HK-2在高糖培養(yǎng)下可出現(xiàn)膽固醇蓄積現(xiàn)象[28]。

在腎臟活檢標(biāo)本中可觀察到在腎小管或腎動(dòng)脈內(nèi)膽固醇結(jié)晶表現(xiàn)為狹長(zhǎng)、兩頭尖、腰部凸的梭形空隙[29]。1985 年Nast等[30]在5例腎病綜合征患者腎活檢標(biāo)本中觀察到腎間質(zhì)中膽固醇肉芽腫形成，認(rèn)為其與腎小管膽固醇晶體之間存在聯(lián)系。上述5例患者腎小管細(xì)胞中均含有脂滴，因此他們認(rèn)為膽固醇晶體最初可能來(lái)源于腎小管上皮內(nèi)的脂質(zhì)。膽固醇或ESC在腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)持續(xù)沉積可能導(dǎo)致胞內(nèi)膽固醇晶核的形成。尿液中的膽固醇過(guò)飽和也可能形成小的膽固醇結(jié)晶。當(dāng)上皮細(xì)胞內(nèi)較大的晶體形成后可在其臨近管腔內(nèi)也發(fā)現(xiàn)膽固醇結(jié)晶。目前關(guān)于細(xì)胞內(nèi)晶體釋放到管腔內(nèi)的機(jī)制尚未明確，而膽固醇結(jié)晶一旦從上皮細(xì)胞內(nèi)進(jìn)入管腔，晶體在管腔內(nèi)可進(jìn)一步擴(kuò)大伸長(zhǎng)或者隨尿液排出。針狀的膽固醇結(jié)晶達(dá)到一定的長(zhǎng)度后可以在腎小管某個(gè)位置被卡住，尖銳邊緣可以扭曲破壞腎小管上皮細(xì)胞，并穿透基膜，隨后暴露于間質(zhì)單核細(xì)胞形成膽固醇肉芽腫(圖1)。此后有關(guān)腎小管中膽固醇結(jié)晶的相關(guān)報(bào)道極少。Hu等[31]研究表明，炎癥通過(guò)上調(diào)血清CXC趨化因子配體16途徑促進(jìn)了腎小管間質(zhì)中脂質(zhì)的蓄積并導(dǎo)致腎小管間質(zhì)損傷。

圖1 膽固醇結(jié)晶誘導(dǎo)腎臟損害的機(jī)制

針狀的膽固醇結(jié)晶在腎小管腔中逐漸增大后陷入腎小管上皮細(xì)胞最終刺破腎小管基膜后引發(fā)巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞激活轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞。

小結(jié)：脂質(zhì)代謝紊亂造成膽固醇蓄積進(jìn)而形成結(jié)晶誘發(fā)炎癥，可導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生和進(jìn)展。膽固醇穩(wěn)態(tài)通常由膽固醇流入和膽固醇外排途徑控制，一旦膽固醇穩(wěn)態(tài)被破壞，隨著膽固醇或ESC的持續(xù)沉積，細(xì)胞內(nèi)膽固醇過(guò)飽和可形成膽固醇結(jié)晶，引起單核吞噬細(xì)胞等介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，炎癥應(yīng)激也可反向誘導(dǎo)脂質(zhì)蓄積而加劇腎臟損傷。腎臟疾病伴脂質(zhì)代謝異常的患者在臨床并不少見(jiàn)，腎病綜合征中腎小管膽固醇結(jié)晶也并非罕見(jiàn)的病理改變。因此,在臨床診治過(guò)程中應(yīng)予以重視,尤其是腎小管內(nèi)的膽固醇結(jié)晶，以便早期發(fā)現(xiàn)早期診治。