朱 妍 彭 琳 張明超 王荔枝 徐孝東 曾彩虹 秦衛(wèi)松 劉志紅

狼瘡性腎炎(LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的常見(jiàn)臨床表現(xiàn),是我國(guó)常見(jiàn)的繼發(fā)性腎小球疾病之一,也是患者死亡的主要原因,約10%的LN患者最終發(fā)展為終末期腎病(ESRD)[1-2]。LN的致病機(jī)制尚不明確,絕大多數(shù)LN患者腎臟中可見(jiàn)免疫球蛋白和補(bǔ)體成分沉積于腎小球和腎小管,伴內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞和基膜損傷等[3]。目前以激素和免疫抑制藥物聯(lián)合治療為主,除了貝利木單抗(一種B淋巴細(xì)胞刺激因子的特異性抑制劑),其他生物制劑和小分子靶向抑制劑仍有待研發(fā)[4]。壞死性凋亡是一種新發(fā)現(xiàn)的程序性細(xì)胞壞死,與凋亡不同,壞死性凋亡細(xì)胞會(huì)釋放細(xì)胞內(nèi)容物,激活巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞,導(dǎo)致免疫和炎癥反應(yīng)[5]。腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)介導(dǎo)的壞死性凋亡是最廣泛最常見(jiàn)的途徑,其中受體交互作用蛋白激酶(RIPK)1作為分子平臺(tái),參與多條信號(hào)通路[6]。RIPK1去泛素化時(shí)激活依賴半胱氨酸蛋白酶(caspase)的促凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng),當(dāng)caspase8受抑制時(shí),RIPK1、RIPK3和混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(MLKL)共同形成壞死小體,此時(shí)MLKL磷酸化,插入胞膜,破壞細(xì)胞膜完整性,導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡[7]。necrostatin-1(Nec-1)是經(jīng)典的RIPK1小分子抑制劑,已在多種動(dòng)物模型中得到了廣泛驗(yàn)證[8]。本研究借助LN樣小鼠和體外系膜細(xì)胞,觀察Nec-1治療LN的療效。

材料與方法

主要試劑與儀器磷酸化(S166)RIP1抗體(美國(guó)CST公司),RIP1抗體(美國(guó)CST公司),磷酸化(S358)MLKL抗體(美國(guó)Abcam公司),MLKL抗體(美國(guó)CST公司),Nec-1(Selleck公司),流式細(xì)胞儀(型號(hào) FACS ARIA)。

實(shí)驗(yàn)對(duì)象和分組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 MRL/lpr小鼠13只,雌性,SPF級(jí),購(gòu)自南京模式動(dòng)物所,放置于東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物房進(jìn)行飼養(yǎng),正常飲食,采用明暗各12h照明。本課題中所有動(dòng)物的使用均已獲得東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。第19周齡MRL/lpr小鼠平均體質(zhì)量30±2.5g,隨機(jī)分成兩組(7例、6例),分別腹腔注射Nec-1[3.5 mg/(kg·d)]和同等劑量溶劑,共計(jì)21d。于第19、20、21和22周收集小鼠尿液,第22周后麻醉處死,收取小鼠血液和腎臟標(biāo)本(每組各5例)。

建模細(xì)胞人系膜細(xì)胞,購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(American type culture collection,ATCC)。采用含10%FBS,青霉素-鏈霉素各100 U/ml的DMEM低糖培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)3～4天后進(jìn)行相關(guān)研究。分成NC組、T/S/Z組、Nec-1組和CTL-N組。分組用100 ng/ml腫瘤壞死因子α(TNF-α)重組蛋白(PeproTech公司)、50μmol/L Z-VAD-FMK(MCE公司)、50 nmol/L SM-164(Selleck公司)誘導(dǎo)細(xì)胞壞死性凋亡,Nec-1處理細(xì)胞。

血清肌酐和尿素氮檢測(cè)取干凈的96孔板,加入稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和小鼠血清樣本。按酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(Bio Assay Systems公司)步驟操作。

血清抗核抗體(ANA)和抗雙鏈DNA(dsDNA)抗體檢測(cè)分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。按照小鼠抗dsDNA抗體和ANA酶聯(lián)免疫分析試劑盒步驟操作。

尿蛋/白肌酐比值測(cè)定收集基線和給藥處理3周的尿樣本,置于-80℃保存,用Bradford法(天根公司)測(cè)定尿總蛋白。計(jì)算尿蛋白/肌酐比值,繪制曲線。

PAS染色制備好的腎臟切片放入乙醇固定10 min,蒸餾水沖洗,晾干。10g/L高碘酸氧化20 min,蒸餾水沖洗,晾干。置于Schiff溶液中室溫染色30～60 min。用亞硫酸溶液沖洗3次,2 min/次,蒸餾水沖洗,晾干。20 g/L甲綠復(fù)染20 min,水洗,晾干。中性樹(shù)脂封片,鏡下拍照。

腎小球病理評(píng)分每張腎組織切片中隨機(jī)選取20個(gè)小球的橫切面(gcs),每個(gè)小球按下列半定量的方式評(píng)分:0=正常(35～40細(xì)胞/gcs);1=輕度,小球少量病變表現(xiàn)為輕度增殖性病變和輕度細(xì)胞增殖(41～50細(xì)胞/gcs),伴或不伴輕微滲出;2=中度,中度細(xì)胞增生(51～60細(xì)胞/gcs),包括節(jié)段和(或)彌漫性增殖性病變,透明性變和中度滲出;3=重度,節(jié)段和(或)全球硬化,伴或不伴重度細(xì)胞增生(>60細(xì)胞/gcs)、壞死、新月體形成和重度滲出。

免疫熒光染色取冰凍切片,通風(fēng)櫥放置30 min去除水汽。正常山羊血清封閉液滴在切片上,室溫放置封閉1h。輕甩玻片,擦去多余的封閉液。用抗體稀釋液稀釋一抗(1∶100),覆蓋切片組織,4 ℃孵育過(guò)夜。PBS緩沖液,稀釋相應(yīng)抗一抗種屬來(lái)源的二抗(1∶200),滴加在玻片上,避光室溫孵育1h,PBS沖洗3次,2 min/次。避光晾干后,滴加含有DAPI的抗淬滅劑封片,干片后4℃保存。

WesternBlot檢測(cè)壞死性凋亡相關(guān)分子表達(dá)提取組織和細(xì)胞蛋白質(zhì),BCA法測(cè)定蛋白濃度,根據(jù)蛋白定量結(jié)果,計(jì)算含20 μg蛋白的溶液體積即為上樣量。在經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,以5%脫脂牛奶封閉1h,TBST洗膜3次,5 min/次;加入對(duì)應(yīng)抗體,4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜,加入濃度為1∶5 000的IgG-HRP的二抗室溫孵育1h,TBST洗膜。ECL檢測(cè)樣本免疫活性,凝膠成像系統(tǒng)分析,Image J軟件得出灰度值。

qRT-PCR檢測(cè)白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)水平收集系膜細(xì)胞,按RNA提取試劑盒(ZYMO Research公司)提取總RNA,并用Nanodrop測(cè)定純度和濃度,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行DNA的合成。引物為IL-1β:5′-CCACAGACCTTCCAGGAGAA TG-3′和5′-GTGCAGTTCAGTGATCGTACAGG-3′。IL-6:5′-CCAGCTATGAACTCCTTCTC-3′和5′-GCTTG TTCCTCACATCTCTC-3′。TNF-α:5′-CTCTTCTGCCT GCTGCACTTTG-3′和5′-ATGGGCTACAGGCTTGTC ACTC-3′。參照物GAPDH:5′-GTCTCCTCTGACTT CAACAG CG-3′和5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGC CAA-3′。qRT-PCR使用SYBR Green法,PCR熱循環(huán)條件:95℃ 30s預(yù)變性,95℃ 5s、60℃ 1 min的熱循環(huán),共40次;儀器為ABI 7900HT Fast Real time System。讀取臨界循環(huán)數(shù)進(jìn)行記錄分析。以正常對(duì)照細(xì)胞為矯正樣本,用比較閾值法計(jì)算目的基因的相對(duì)含量。

細(xì)胞活性檢測(cè)在96孔板中接種細(xì)胞懸液(100 μl/孔)。將培養(yǎng)板放在37℃培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)。待細(xì)胞快長(zhǎng)滿孔板,按不同分組加入藥物處理,每組6個(gè)復(fù)孔,處理24h。于培養(yǎng)箱中取出待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)板,室溫放置30 min,以使培養(yǎng)板溫度平衡至室溫。加入與待測(cè)細(xì)胞等體積(100 μl)并平衡至室溫的細(xì)胞活力檢測(cè)試劑Cell Counting-Lite 2.0(Promega公司),振蕩混勻5 min使細(xì)胞充分裂解。室溫放置10 min以穩(wěn)定發(fā)光信號(hào),使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光素酶信號(hào)。整理數(shù)據(jù),分析結(jié)果。

流式細(xì)胞術(shù)系膜細(xì)胞分組,加不同的處理藥物。用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞,離心棄上清。按照經(jīng)典膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-FITC/碘化丙啶(PI)雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒步驟進(jìn)行操作。1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,數(shù)據(jù)應(yīng)用《Prism8》軟件(GraphPadSoftware)進(jìn)行分析,兩組間比較t檢驗(yàn)分析,多組間比較采用單因素方差分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

Nec-1緩解MRL/lpr小鼠的自身免疫炎癥反應(yīng)我們用Nec-1和對(duì)照溶劑處理19周齡的MRL/lpr小鼠,3周后通過(guò)ELISA檢測(cè)血清學(xué)指標(biāo)。結(jié)果提示,和對(duì)照組相比,Nec-1處理的小鼠血清ANA(圖1A)和抗dsDNA抗體滴度顯著降低(圖1B)。

圖1 Nec-1降低狼瘡樣小鼠的血清ANA(A)和抗dsDNA抗體(B)水平ANA:抗核抗體；抗dsDNA抗體：抗雙鏈DNA抗體；Nec-1:necrostatin-1

Nec-1可緩解MRL/lpr小鼠的腎臟損傷對(duì)照組小鼠尿蛋白/肌酐比值隨著周齡增加呈進(jìn)行性增高,Nec-1處理的LN小鼠,尿蛋白/肌酐比值明顯降低,治療3周后兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2A)。同時(shí), Nec-1處理組小鼠血清肌酐和尿素氮水平也顯著下降(圖2B、C)。Nec-1治療組病理表型良好，增殖性病變和滲出較輕，腎小球病理評(píng)分明顯低于對(duì)照組(圖2D)。免疫熒光結(jié)果提示,Nec-1處理組小鼠腎小球IgG、C3沉積減少(圖2E)。PAS染色結(jié)果提示,與對(duì)照組相比,Nec-1組腎小球增生硬化程度降低,間質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)減少(圖2F)。

圖2 Nec-1緩解狼瘡性腎炎小鼠的腎臟損傷Nec-1:necrostatin-1;A:對(duì)照組和Nec-1組尿蛋白/肌酐比值;B:對(duì)照組和Nec-1組血清肌酐水平;C:對(duì)照組和Nec-1組血清尿素氮水平;D:腎小球病理評(píng)分；E:Nec-1處理組小鼠C3、IgG沉積減少(IF，×400);F:Nec-1組腎小球硬化程度降低，間質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)減少(F1～2：PAS,×200，E3～4:PAS,×400)

Nec-1抑制狼瘡性腎炎小鼠系膜細(xì)胞的壞死性凋亡通路表達(dá)提取小鼠腎皮質(zhì)總蛋白,Western Blot結(jié)果顯示和對(duì)照組相比,Nec-1處理組磷酸化RIPK1與非磷酸化RIPK1的比值降低,磷酸化MLKL與非磷酸化MLKL的比值也降低(圖3A),提示壞死性凋亡信號(hào)通路受到抑制。將系膜細(xì)胞與壞死性凋亡相關(guān)分子進(jìn)行免疫熒光共染,結(jié)果提示,LN小鼠系膜細(xì)胞高表達(dá)磷酸化RIPK1和磷酸化MLKL,而Nec-1處理組磷酸化RIPK1和磷酸化MLKL表達(dá)下調(diào)(圖3B、C)。

圖3 Nec-1抑制LN小鼠腎臟壞死性凋亡通路相關(guān)分子表達(dá)RIPK1:受體交互作用蛋白激酶1;MLKL:混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白；LN：狼瘡性腎炎；Nec-1:necrostatin-1;PDGFR-β:血小板來(lái)源生長(zhǎng)因子受體β;P-RIPK1：磷酸化RIPK1；P-MLKL：磷酸化MLKL；A:Western Blot檢測(cè)P-RIPK1和P-MLKL分子表達(dá);B:免疫熒光染色觀察系膜細(xì)胞標(biāo)志物PDGFR-β和P-RIPK1(IF，×400);C:免疫熒光染色觀察系膜細(xì)胞標(biāo)志物PDGFR-β和P-MLKL(IF，×400)

Nec-1降低體外人系膜細(xì)胞壞死性凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)通過(guò)TNF-α、SM-164、Z-VAD-FMK共刺激體外系膜細(xì)胞,可有效誘導(dǎo)細(xì)胞壞死性凋亡。采用10 μmol/L Nec-1按照時(shí)間梯度處理6h、12h、24h,觀察到24h磷酸化RIPK1和磷酸化MLKL的蛋白表達(dá)顯著降低(圖4A)。另一方面,以不同濃度(1 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L)Nec-1處理細(xì)胞24h,均可顯著降低磷酸化RIPK1和磷酸化MLKL的蛋白表達(dá)(圖4B),提示Nec-1有效抑制系膜細(xì)胞的壞死性凋亡相關(guān)分子的表達(dá)(圖4B)。

圖4 Nec-1抑制RIPK1依賴的壞死性凋亡通路T:TNF-α，腫瘤壞死因子α;S:SM-164;Z:Z-VAD-FMK;RIPK1:受體交互作用蛋白激酶1;MLKL:混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白；Nec-1:necrostatin-1;P-RIPK1:磷酸化RIPK1;P-MLKL:磷酸化MLKL;A:Western Blot顯示Nec-1處理24h后P-RIPK1和P-MLKL的蛋白表達(dá)情況;B:Western Blot顯示1 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L Nec-1處理系膜細(xì)胞24h后P-RIPK1和磷酸化MLKL的蛋白表達(dá)情況

Nec-1有效抑制細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡Nec-1處理細(xì)胞24h時(shí),ATP含量最多,提示細(xì)胞壞死性凋亡受到抑制(圖5A)。不同濃度Nec-1處理均可有效阻斷細(xì)胞壞死性凋亡過(guò)程(圖5B)。既往研究表明[9],發(fā)生壞死性凋亡的細(xì)胞可與Annexin V結(jié)合。流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示,與誘導(dǎo)壞死性凋亡組相比,Nec-1處理組Annexin V+/PI+的細(xì)胞和Annexin V+/PI-的細(xì)胞數(shù)量均顯著減少,說(shuō)明Nec-1對(duì)細(xì)胞程序性死亡具有顯著抑制作用(圖5C)。

圖5 Nec-1有效抑制細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡Nec-1:necrostatin-1;T:TNF-α,腫瘤壞死因子α;S:SM-164,;Z:Z-VAD-FMK;NC：對(duì)照組；Nec-1組:Nec-1處理壞死性凋亡組；CTL-N組：Nec-1處理對(duì)照組；A:檢測(cè)Nec-1處理系膜細(xì)胞6h、12h、24h后細(xì)胞活性變化;B:1 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L Nec-1處理后細(xì)胞活性變化;C:流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞不同時(shí)期凋亡

Nec-1下調(diào)系膜細(xì)胞IL-1β和IL-6的表達(dá)通過(guò)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的系膜細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡,提取RNA進(jìn)行qRT-PCR,結(jié)果顯示,發(fā)生壞死性凋亡的系膜細(xì)胞IL-1β和IL-6的表達(dá)增高,給予10μmol/L Nec-1處理24h后IL-1β和IL-6 mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)(圖6A、B)。另外,TNF-α的mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化,且Nec-1無(wú)明顯抑制作用(圖6C)。以上結(jié)果提示,RIPK1抑制劑Nec-1對(duì)體外系膜細(xì)胞壞死性凋亡過(guò)程中產(chǎn)生的促炎因子具有抑制作用。

圖6 Nec-1下調(diào)系膜細(xì)胞中IL-1β和IL-6 mRNA的表達(dá)Nec-1:necrostatin-1;T:TNF-α,腫瘤壞死因子α;S:SM-164;Z:Z-VAD-FMK;IL:白細(xì)胞介素;CTL-N組：Nec-1處理對(duì)照組;NC:對(duì)照組;A:qRT-PCR顯示壞死性凋亡過(guò)程中IL-1β mRNA的表達(dá)變化;B:qRT-PCR顯示壞死性凋亡過(guò)程中IL-6 mRNA的表達(dá)變化;C:qRT-PCR顯示壞死性凋亡過(guò)程中TNF-α mRNA的表達(dá)變化

討 論

壞死性凋亡在多種自身免疫性疾病和腎臟疾病中發(fā)揮著重要作用[10-11]。研究發(fā)現(xiàn),在SLE患者的B細(xì)胞中觀察到壞死性凋亡的增加[12]。Sarhan等[13]發(fā)現(xiàn)SLE中干擾素信號(hào)增強(qiáng),進(jìn)一步放大壞死性凋亡,為自身免疫過(guò)程中病理性干擾素與組織損傷之間提供了關(guān)聯(lián)。另外,SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的MLKL mRNA表達(dá)上調(diào),而與未合并LN的患者相比,發(fā)現(xiàn)LN患者的MLKL mRNA上調(diào),并且處于疾病活動(dòng)期的患者也高于疾病穩(wěn)定患者[14]。開(kāi)發(fā)壞死性凋亡調(diào)控過(guò)程中關(guān)鍵蛋白的分子抑制劑,是抑制疾病進(jìn)程中壞死性凋亡發(fā)生的有效方式。本研究探討了LN小鼠系膜細(xì)胞中RIPK1和壞死性凋亡通路的激活,發(fā)現(xiàn)RIPK1抑制劑Nec-1能有效阻斷小鼠系膜細(xì)胞壞死性凋亡信號(hào)通路,減輕LN小鼠的全身免疫炎癥反應(yīng),同時(shí)顯著緩解腎臟損傷。表現(xiàn)為L(zhǎng)N小鼠ANA和抗dsDNA抗體滴度下降,尿蛋白降低,血清肌酐、尿素氮水平顯著下降,腎臟C3、IgG沉積減少,腎小球增殖性病變和硬化程度減輕,細(xì)胞浸潤(rùn)減少,證實(shí)了Nec-1治療LN的療效。

系膜細(xì)胞是特殊的平滑肌細(xì)胞,不僅合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì),還起到吞噬和分泌多種促炎癥因子和生長(zhǎng)因子的作用[15]。在LN中,循環(huán)的抗dsDNA抗體可與系膜細(xì)胞結(jié)合,引起纖維化、炎癥、凋亡等反應(yīng),染色質(zhì)堆積形成的電子致密物進(jìn)一步擴(kuò)大免疫炎癥反應(yīng)[16]。一項(xiàng)研究報(bào)道,LN患者抗dsDNA抗體和腎小球細(xì)胞增殖和凋亡呈高度相關(guān),提示抗dsDNA抗體可誘導(dǎo)體內(nèi)系膜細(xì)胞增殖與凋亡[17]。而利用抗dsDNA抗體刺激體外人系膜細(xì)胞,可以增加IL-1β、IL-6 和TNF-α的分泌[18-19]。本研究在體外系膜細(xì)胞中激活壞死性凋亡通路,驗(yàn)證了Nec-1可抑制其相關(guān)分子的表達(dá),阻斷系膜細(xì)胞壞死性凋亡,維持細(xì)胞活性,減少促炎因子的表達(dá)。

綜上所述,本研究結(jié)果證明RIPK1抑制劑Nec-1治療LN小鼠具有一定療效,提示Nec-1可能成為治療SLE和LN的潛在小分子生物抑制劑。