周桃桃 綜述 郭兆安 審校

盡管部分急性腎損傷(AKI)患者在治療后腎臟功能可恢復(fù)正常,但腎組織中遺留的病理改變短期內(nèi)不能完全恢復(fù),有研究報(bào)道在十年的隨訪中,AKI向慢性腎臟病(CKD)發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)增加了25%,死亡率增加了50%[1]。最近的研究證實(shí)AKI和CKD存在內(nèi)在聯(lián)系,在AKI中存在的腎小管上皮細(xì)胞損傷、炎細(xì)胞浸潤(rùn)和血管功能障礙等病理改變,可激活腎臟的自我修復(fù)機(jī)制,如缺血再灌注、抑制內(nèi)源性干細(xì)胞和祖細(xì)胞在腎臟的遷移、歸巢和旁分泌,同時(shí)促進(jìn)腎間質(zhì)中的成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)增殖、活化,進(jìn)一步增加了向CKD發(fā)展的可能[2]。外泌體在腎臟生理病理過(guò)程中的細(xì)胞通訊、診斷和治療作用已得到充分認(rèn)可,并在AKI轉(zhuǎn)為CKD過(guò)程中扮演者重要角色。因此,全面系統(tǒng)開(kāi)展外泌體對(duì)AKI的作用研究,對(duì)未來(lái)解密其作用機(jī)制,改善AKI的預(yù)后尤為重要。

外泌體的特征與作用

細(xì)胞外囊泡(EVs)是細(xì)胞釋放到外環(huán)境中的多樣化膜性囊泡,包括外泌體、微囊泡(MVs)、凋亡小體。外泌體直徑為40～120 nm,是細(xì)胞膜內(nèi)陷以出芽方式形成的包含有miRNA 、DNA片段及功能性蛋白的分泌囊泡,并通過(guò)三種形式完成細(xì)胞通訊:一是外泌體膜蛋白與靶細(xì)胞膜蛋白結(jié)合,二是外泌體膜蛋白被蛋白酶剪切,剪切的碎片作為配體與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合,三是外泌體膜與靶細(xì)胞膜直接融合。不同于其他EVs,外泌體具有轉(zhuǎn)移RNA、蛋白質(zhì)、酶和脂質(zhì)的能力,可以調(diào)節(jié)血管生成、抗原呈遞、細(xì)胞凋亡等生理病理過(guò)程[3]。外泌體如何在體內(nèi)靶向受體細(xì)胞的機(jī)制仍然未知,目前發(fā)現(xiàn),基因工程改造可使外泌體的跨膜蛋白表現(xiàn)出配體/同源肽,從而賦予外泌體靶向于帶有同源受體細(xì)胞的能力。

腎臟外泌體主要起源于足細(xì)胞、近曲小管、尿血管袢粗大上升肢、遠(yuǎn)曲小管和集合管。這些外泌體富含來(lái)自腎單位的蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,能增加細(xì)胞間通訊以發(fā)揮生理作用,如近曲小管細(xì)胞外泌體可將3-磷酸甘油醛脫氫酶遞送至遠(yuǎn)曲小管以修復(fù)損傷的腎小管上皮[4],加壓素類(lèi)似物處理的導(dǎo)管細(xì)胞外泌體表達(dá)的水通道蛋白(AQP)2能誘導(dǎo)鄰近細(xì)胞上調(diào)AQP-2的表達(dá)以增強(qiáng)水的重吸收[5]。另外,外泌體中的蛋白質(zhì)和miRNA可作為早期診斷和評(píng)估AKI進(jìn)展的生物學(xué)標(biāo)志物,已證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子3、胎球蛋白A、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)的脂蛋白等可作為AKI診斷的潛在標(biāo)志物,而miR-16,miR-24和miR-200c升高可反映出腎臟病變處于早期(或損傷階段),miR-125和miR-351升高可反映出腎臟病變處于晚期(或纖維化階段)[6]。

外泌體對(duì)AKI發(fā)展為CKD的調(diào)控機(jī)制

在AKI發(fā)展中,源自病變腎臟的細(xì)胞外泌體可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和腎小管損傷、抑制血管生成和促進(jìn)腎臟纖維化,而源自間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)、人羊膜上皮細(xì)胞、尿液干細(xì)胞等外源性外泌體作用恰好相反。外泌體的作用機(jī)制見(jiàn)圖1。

圖1 外泌體在急性腎損傷發(fā)展為CKD 中的作用機(jī)制CKD:慢性腎臟病;IRAK1:白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶1抗體;AKT:蛋白酶B;Bcl-2:B淋巴細(xì)胞瘤-2;NOX:還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的非吞噬細(xì)胞氧化酶;IGF-1:胰島素樣生長(zhǎng)因子-1;Ets2:骨髓成紅細(xì)胞增多癥病毒E26癌基因同源物2;TGF-β:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β;GGT-2:γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶2;HIF-1:缺氧誘導(dǎo)因子1;Sox-9:人性別決定區(qū)Y框蛋白9;Hgf:肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子;EGF:表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子;VEG:血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;YAP:Yes相關(guān)蛋白;NO:一氧化氮

炎癥反應(yīng)持續(xù)性缺血缺氧導(dǎo)致腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,誘導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和炎性介質(zhì)釋放。炎癥反應(yīng)貫穿于AKI的各個(gè)階段,但具體作用機(jī)制尚未明確,而外泌體在其中扮演重要角色。

外泌體能夠誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。在損傷腎臟中,腎小球內(nèi)皮細(xì)胞外泌體暴露表面的激肽B1受體和白細(xì)胞介素8(IL-8),吸引中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)[7],腎小管上皮細(xì)胞(TEC)分泌含有miR-19b-3p的外泌體,通過(guò)減弱核因子κB(NF-κB)信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白1的表達(dá),促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞活化,致腎小管間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[8],而暴露于白蛋白的TECs外泌體釋放的能表達(dá)趨化因子配體2(CCL2)的mRNA靶向作用于巨噬細(xì)胞,誘導(dǎo)間質(zhì)炎癥發(fā)生[9]。

另一方面,外泌體具有抗炎作用。在膿毒癥誘導(dǎo)的AKI小鼠中,脂肪MSC外泌體通過(guò)增加SIRT1的分泌抑制NF-κB的活性并減弱腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-1、IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白1的轉(zhuǎn)錄、生成和釋放[10]。人羊膜上皮細(xì)胞外泌體可保護(hù)人腎皮質(zhì)近曲小管上皮(HK-2)細(xì)胞免受缺氧/復(fù)氧的損傷,并可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2表型極化,分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10或轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)以下調(diào)免疫應(yīng)答[11]。在缺血-再灌注損傷(IRI)誘導(dǎo)的AKI中,人尿液干細(xì)胞外泌體分泌的miR-146a-5p通過(guò)參與TNF的負(fù)反饋調(diào)節(jié),抑制IL-1受體相關(guān)激酶1(IRAK1)的表達(dá),減少I(mǎi)RAK1介導(dǎo)的Toll樣受體和細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)受體相關(guān)因子6的釋放,從而減輕炎癥反應(yīng)并保護(hù)HK-2細(xì)胞[12]。

腎小管損傷近端腎小管細(xì)胞損傷是AKI的特征性病理改變。在嚴(yán)重缺血、缺氧、炎癥等作用下TECs增殖周期異常,進(jìn)一步增加TGF-β和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)的基因表達(dá)及蛋白合成分泌,加重腎小管的損傷。另外,炎癥細(xì)胞因子持續(xù)活化和局部蛋白酶對(duì)基膜的破壞可誘導(dǎo)TECs向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

外泌體可誘導(dǎo)腎小管損傷。在AKI時(shí),TECs外泌體分泌的miR-21作用于鄰近的受體小管,并通過(guò)抑制磷酸酶和張力蛋白同源物蛋白的活性增強(qiáng)蛋白激酶B(Akt)信號(hào)傳導(dǎo),促進(jìn)腎小管表型轉(zhuǎn)變[13]。損傷足細(xì)胞外泌體分泌的miR-424和miR-149促進(jìn)HK2細(xì)胞凋亡和p38磷酸化,分泌的miR-200促進(jìn)TGF-β1表達(dá)和誘導(dǎo)TECs向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[14]。腎小管間質(zhì)成纖維細(xì)胞外泌體分泌的miR-153-3p抑制近端TECs的B淋巴細(xì)胞瘤-2基因表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。

另一方面,外泌體可保護(hù)或修復(fù)腎小管。MSC外泌體能上調(diào)腎小管細(xì)胞的Bcl-xL、Bcl2和BIRC8抗凋亡基因,下調(diào)胱天蛋白酶(Casp)1、Casp8和LTA凋亡基因,尿液干細(xì)胞外泌體能抑制TECs的凋亡基因caspase-3過(guò)表達(dá)[16]。骨髓MSC外泌體可減輕TECs的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡,促進(jìn)體內(nèi)外細(xì)胞增殖,修復(fù)順鉑誘導(dǎo)的AKI大鼠損傷的TECs[17],脂肪MSC外泌體激活腎小管Sox9基因,增強(qiáng)近端腎小管細(xì)胞去分化和有效增殖,改善細(xì)胞周期阻滯和缺氧,促進(jìn)腎小管修復(fù)和再生[1]。

微血管損傷周?chē)?xì)血管稀疏是AKI向慢性腎纖維化發(fā)展的典型特征。各種AKI的動(dòng)物模型(葉酸、輸尿管阻塞、缺血再灌注等)研究顯示,腎臟損傷后毛細(xì)血管叢密度減少30%～50%,腎間質(zhì)處于缺氧狀態(tài),能加重間質(zhì)炎癥和纖維化。

外泌體可抑制血管的生成。研究顯示,血小板、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞外泌體依賴磷脂酰絲氨酸和CD36作用刺激肉瘤基因(Src)和NOX家族激酶信號(hào)通路,誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生,抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管狀結(jié)構(gòu)形成,從而抑制血管生成[18]。內(nèi)皮細(xì)胞外泌體分泌的miR-320可下調(diào)胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)、重組人熱激蛋白20(HSP20)、Ets2靶基因抑制血管生成[19]。另外,循環(huán)中的部分EVs可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放一氧化氮并損傷內(nèi)皮依賴性血管的舒張功能,從而損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞[20]。

另一方面,外泌體可促進(jìn)血管的新生。IRI誘導(dǎo)的AKI小鼠存在腎小管周?chē)?xì)血管的顯著缺損,給予人羊膜上皮細(xì)胞外泌體治療后,血管生成相關(guān)基因(Egf,Fgf,Hgf,Igf-1,Pdgf和Vegf)水平顯著上調(diào)[11],給予褪黑激素聯(lián)合MSC外泌體治療后,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和胰島素樣生長(zhǎng)因子1等促血管生成因子的表達(dá)明顯增加,管周毛細(xì)血管的密度也隨之增加[21]。在糖尿病腎病大鼠模型中,檢測(cè)到尿液干細(xì)胞外泌體內(nèi)富含生長(zhǎng)因子、血管生成素和骨形態(tài)發(fā)生蛋白7等,這些物質(zhì)均與血管再生密切相關(guān)[22]。

腎臟纖維化AKI腎臟中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小管損傷和微血管損傷等病理改變均可增加促纖維因子釋放,導(dǎo)致腎纖維化。TGF-β是與纖維化密切相關(guān)的因子,在纖維化發(fā)生中具有雙重作用,正常表達(dá)可抑制炎癥和細(xì)胞增生、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)分化和免疫,而過(guò)度表達(dá)會(huì)引起組織纖維化。

外泌體促進(jìn)腎臟纖維化。缺血缺氧刺激的TECs可釋放富含miR-150、TGF-βmRNA的外泌體,進(jìn)一步促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖[11],而在單側(cè)輸尿管結(jié)扎的腎纖維化小鼠中,TGF-β1可反向刺激TECs分泌富含谷氨酰胺酶2的外泌體,從而改變細(xì)胞外穩(wěn)態(tài)和促進(jìn)腎纖維化[23]。研究發(fā)現(xiàn),CKD患者尿液外泌體中miR-29c顯著升高,且與腎小管間質(zhì)纖維化程度呈正相關(guān)[24]。

另一方面,外泌體可抑制腎臟纖維化。骨髓MSC外泌體分泌的miR-let7c可下調(diào)單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎臟中的膠原IVα1、金屬蛋白酶9、TGF-β1和TGF-β1型受體水平,并抑制大鼠腎小管導(dǎo)管上皮細(xì)胞中促纖維化基因的表達(dá),從而減弱腎臟纖維化[25]。人臍帶MSC外泌體通過(guò)CK1δ/β-TRCP信號(hào)傳導(dǎo)途徑增強(qiáng)yes相關(guān)蛋白(YAP)的泛素化和降解,以減輕膠原蛋白沉積和腎纖維化[26]。人脂肪MSC外泌體激活TECs上的管狀Sox9,阻止TGF-β1誘導(dǎo)的TECs向促纖維化表型的轉(zhuǎn)化,從而減緩腎纖維化的進(jìn)程[1]。

EVs負(fù)載藥物干預(yù)疾病進(jìn)展

炎癥是腎臟疾病進(jìn)展的關(guān)鍵病理改變,然而免疫抑制劑具有靶向不準(zhǔn)、毒副作用較多的缺點(diǎn)。EVs具有穩(wěn)定的細(xì)胞間靶向通訊的作用,被視為天然的納米級(jí)藥物載體,其作為載體可改善藥物藥代動(dòng)力學(xué),減少毒副作用,相對(duì)于人工合成的納米載體而言,具有足夠時(shí)長(zhǎng)的循環(huán)半衰期,并可穿透組織深處和逃避免疫系統(tǒng)的清除。在AKI中應(yīng)用EVs負(fù)載藥物能起到有效的抗炎作用。EVs負(fù)載姜黃素可瞬時(shí)增加促炎性細(xì)胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)基因的表達(dá),并抑制雌二醇的產(chǎn)生和CYP19A1基因的表達(dá),減輕脂多糖介導(dǎo)的炎癥,從基因?qū)用嬉种蒲装Y[27]。IL-10是一種強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)劑,負(fù)載IL-10的EVs表面富含整合素α1β1、L2和M2等黏附分子,可靶向作用于TECs并抑制雷帕霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),促進(jìn)線粒體適應(yīng)性反應(yīng),也可靶向作用于腎小管間質(zhì)中的巨噬細(xì)胞,驅(qū)動(dòng)M2型巨噬細(xì)胞極化,從而顯著改善腎小管萎縮、TECs變平和脫落、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維化[28]。負(fù)載地塞米松的巨噬細(xì)胞MVs表面富含整合素αLβ2和α4β1,能靶向作用于腎臟炎癥細(xì)胞,下調(diào)腎臟中TNF、IL-6、IL-β和CCL-2的mRNA表達(dá)以及NF-κBp65和p-p65蛋白的表達(dá),從而減輕炎癥,另外還可減輕蛋白尿、腎小球病變和腎小管間質(zhì)損傷,且沒(méi)有出現(xiàn)明顯的糖皮質(zhì)激素性副作用[29]。在治療時(shí),選擇最佳的供體細(xì)胞是建立有效的藥物運(yùn)輸系統(tǒng)的前體,目前尚缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),主要以MSC、樹(shù)突細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞為主,而MSC被認(rèn)為是較理想的具有免疫調(diào)節(jié)和治療的細(xì)胞來(lái)源[30]。另外,可通過(guò)人工修飾增加外泌體的靶向性,如在親本細(xì)胞中導(dǎo)入表達(dá)靶向配體和跨膜蛋白域的融合質(zhì)粒,或在外泌體表面涂覆靶向抗體。

小結(jié)與展望

在AKI中,不同來(lái)源的外泌體具有雙重作用,既有促進(jìn)疾病發(fā)展的外泌體,也有治療疾病的外源性外泌體,其功能的體現(xiàn)取決于不同外界刺激和起源細(xì)胞種類(lèi)的不同。臨床研究已證實(shí)外泌體可通過(guò)靶向治療延緩AKI向CKD轉(zhuǎn)變。外泌體亦可作為非侵入性生物標(biāo)志物用于診斷疾病和評(píng)估疾病預(yù)后。然而,目前外泌體負(fù)載藥物治療的臨床研究較少,且外泌體分離技術(shù)還不能保證分離的純度、速度,也不具備同時(shí)處理大量樣品的能力。隨著研究的深入,一種基于中空纖維生物反應(yīng)器的3D外泌體培養(yǎng)系統(tǒng)已問(wèn)世,可以連續(xù)高效地生產(chǎn)外泌體,大大提高了外泌體收集效率,并在治療順鉑誘導(dǎo)的AKI中體現(xiàn)出了強(qiáng)大的腎臟保護(hù)能力[31]。外泌體的研究和應(yīng)用為納米醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供了機(jī)遇,我們相信功能型外泌體作為藥物載體的局限性會(huì)被逐步攻克,將為臨床診療疾病提供新思路和新方法。