孫 寧，鐘天鷹，陳亞軍，陳 辰，陳 晨

南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 南京 210004

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥（intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP）是一種妊娠期間發(fā)生的特異性肝病，其主要特征表現(xiàn)為孕晚期皮膚瘙癢，血清膽汁酸升高。ICP是一種可逆性膽汁淤積癥［1-2］。目前普遍認(rèn)為高濃度膽汁酸的毒性作用會(huì)導(dǎo)致圍生兒產(chǎn)生各種并發(fā)癥［3］。血清總膽汁酸（total bile acid，TBA）是目前臨床上最常用的診斷ICP的指標(biāo)，可單獨(dú)或與血清轉(zhuǎn)氨酶聯(lián)合檢測，用于胎兒不良事件的診斷以及預(yù)測預(yù)后［4］。然而近年來，隨著實(shí)驗(yàn)室技術(shù)的發(fā)展，有更靈敏的手段可用于評估血清膽汁酸濃度。血清膽汁酸譜的某些成分在診斷ICP、確定其嚴(yán)重程度和監(jiān)測其治療反應(yīng)時(shí)，相比TBA，可能提供更特異的信息［5-6］。

臨床上還存在一種被稱為無癥狀高膽汁酸血癥（asymptomatic hypercholanemia of pregnancy，AHP）的疾?。?］，其特征是患者僅表現(xiàn)出TBA 升高，整個(gè)孕期無任何瘙癢癥狀。過去普遍認(rèn)為AHP 是一種妊娠期的亞健康狀態(tài)，妊娠結(jié)局良好。不過國內(nèi)曾有1例AHP孕婦胎兒死亡的報(bào)道［8］。目前對于AHP 的研究和認(rèn)識還很少，臨床上其容易與ICP 混淆［9］。因此，通過研究血清膽汁酸譜，找出ICP 和AHP血清中差異性的膽汁酸，對正確診斷和認(rèn)識這兩種疾病有重要意義。

基于以上信息，本研究利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）的方法，分析ICP孕婦以及AHP孕婦的膽汁酸譜成分，找出兩者之間差異性的膽汁酸，為臨床更好地診斷這兩種疾病提供重要依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象

本研究納入2018年6月—2020年2月于南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院門診就診的孕婦共190 例。其中健康組100例，ICP組60 例，AHP組30例。ICP的診斷標(biāo)準(zhǔn)遵循《妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥診療指南2015》［10］提出的建議：①出現(xiàn)其他原因無法解釋的皮膚瘙癢；②空腹TBA≥10 μmol/L；③膽汁酸水平正常，但有其他原因無法解釋的肝功能異常；④皮膚瘙癢和肝功能異常在產(chǎn)后恢復(fù)正常。AHP 的診斷目前沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)早期西班牙相關(guān)學(xué)者提出的AHP 定義［11］，我們將其診斷標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為空腹TBA≥10 μmol/L，無瘙癢癥狀，血清轉(zhuǎn)氨酶等生化相關(guān)指標(biāo)正常。所有納入的孕婦均排除妊娠期脂肪肝、妊娠期糖尿病、妊娠期高血壓、病毒性肝炎、膽結(jié)石或其他膽道疾病，無其他合并癥或并發(fā)癥及其他妊娠期相關(guān)疾病。調(diào)查研究對象的臨床信息包括年齡、孕周、實(shí)驗(yàn)室生化肝酶指標(biāo)。所有研究對象于上午8點(diǎn)到10點(diǎn)空腹采集靜脈血4 mL。離心后取上清，置于-80 ℃深低溫冰箱保存待用。本研究經(jīng)過南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過，所有參與研究者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 儀器和試劑

AB SCIEX 4500MD型液質(zhì)聯(lián)用儀（SCIEX公司，美國）；色譜柱Phenomenex（Gemini NX 3 μ C18 110A 100×2.0 mm）；膽酸（cholic acid，CA）、脫氧膽酸（deoxycholic acid，DCA）、鵝脫氧膽酸（chenodeoxycholic acid，CDCA）、熊脫氧膽酸（ursodeoxychofic acid，UDCA）、石膽酸（lithocholic acid，LCA）、甘氨結(jié)合型膽酸（glycocholic acid，GCA）、甘氨結(jié)合型脫氧膽酸（glycodeoxycholic acid，GDCA）、甘氨結(jié)合型鵝脫氧膽酸（glycohenodeoxycholic acid，GCDCA）、甘氨結(jié)合型熊脫氧膽酸（glycoursodeoxycholic acid，GUDCA）、甘氨結(jié)合型石膽酸（glycolithocholic acid，GLCA）、牛磺結(jié)合型膽酸（Taurocholic acid，TCA）、?；墙Y(jié)合型脫氧膽酸（taurodeoxycholic acid，TDCA）、牛磺結(jié)合型鵝脫氧膽酸（taurochenodeoxycholic acid，TCDCA）、?；墙Y(jié)合型熊脫氧膽酸（tauroursodeoxycholic acid，TUDCA）、?；墙Y(jié)合型石膽酸（taurolithocholic acid，TLCA）的標(biāo)準(zhǔn)品及同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)氘代甘氨結(jié)合型膽酸（GCA-d5）、氘代脫氧膽酸（DCAd5）、氘代鵝脫氧膽酸（CDCA-d4）、氘代甘氨結(jié)合型鵝脫氧膽酸（GCDCA-d7）、氘代石膽酸（LCA-d4）均購自美國Sigma Aldrich公司。

1.2.2 樣品處理

取血漿樣品50 μL，先后加入25 μL 250 nmol/L的膽汁酸混合內(nèi)標(biāo)溶液和150 μL 乙腈，混勻，15 000 r/min 4 ℃離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液100 μL，再加入100 μL純水稀釋，混勻，取上清100 μL待測。

1.2.3 色譜條件

色譜柱使用Phenomenex（Gemini NX 3 μ C18 110A 100×2.0 mm）進(jìn)行分離，流動(dòng)相選用水（含0.1%甲酸和0.5%氨水）作為A相，乙腈作為B相，柱溫設(shè)為40 ℃，進(jìn)行梯度洗脫。離子源為電噴霧離子源（ESI），掃描方式為負(fù)離子掃描，檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），毛細(xì)管電壓3.0 kV，離子源溫度150 ℃。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SIMCA-P 14.0（Umetrics 公司，瑞典）對數(shù)據(jù)進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（orthogonal projections to latent structures，OPLS-DA），常規(guī)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS24.0 軟件（IBM 公司，美國）。數(shù)據(jù)的正態(tài)性檢驗(yàn)采用Kolmogorov-Smirnon 檢驗(yàn)。正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。偏態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)（四分位數(shù)）［M（P25，P75）］表示，組間比較采用Kruskal-WallisH秩和檢驗(yàn)。各組間計(jì)數(shù)資料均采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。以上方法的檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。3組間計(jì)數(shù)資料的兩兩比較采用經(jīng)Bonferroni 校正后的檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.017。通過ROC 曲線分析差異性膽汁酸以及聯(lián)合指標(biāo)的診斷效能。

2 結(jié)果

2.1 入組者一般信息

孕婦臨床資料見表1。3 組孕婦之間年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，孕周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ICP 組與AHP 組孕周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)室結(jié)果中，3組肝功能和TBA的差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 孕婦的臨床資料信息Table 1 Clinical data of puerpera

2.2 3組的妊娠結(jié)局比較

3組妊娠結(jié)局的比較見表2，在羊水糞染、轉(zhuǎn)NICU 率以及醫(yī)源性早產(chǎn)方面3 組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ICP 組的羊水糞染率、轉(zhuǎn)NICU 率、胎兒窘迫率以及醫(yī)源性早產(chǎn)率比正常妊娠組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；AHP 組的醫(yī)源性早產(chǎn)率比正常妊娠組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ICP組的羊水糞染和轉(zhuǎn)NICU率明顯高于AHP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 3組妊娠結(jié)局的比較Table 2 Comparison of pregnancy outcomes among three groups ［n（%）］

2.3 膽汁酸譜結(jié)果比較

3組之間的膽汁酸譜結(jié)果分析見表3，統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，15種膽汁酸中除CDCA外，其余在3組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩兩比較中，ICP 組與AHP組DCA的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；除DCA、CDCA和UDCA外，ICP組與正常妊娠組的其余膽汁酸比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；除CA、DCA、CDCA，UDCA 和LCA外，AHP組和正常妊娠組的其余膽汁酸比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 3組膽汁酸濃度比較Table 3 Comparison of bile acid concentration among three groups ［μmol/L，M（P25，P75）］

在3 組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的膽汁酸中，發(fā)現(xiàn)ICP組和AHP 組與正常妊娠組濃度相差最大的膽汁酸為GCA、TCA 和TCDCA，其中GCA 濃度分別比正常妊娠組高了89 倍和41 倍；TCA 濃度分別比正常妊娠組高了500 倍和115 倍；TCDCA 濃度分別比正常妊娠組高了61倍和28倍（圖1）。

圖1 3組間GCA、TCA、TCDCA濃度比較Figure 1 Comparison of GCA，TCA and TCDCA concentrations among the three groups

2.4 血清膽汁酸譜模式識別

利用主成分分析（principal component analysis，PCA），初步觀察ICP 組、AHP 組和正常妊娠組的樣本分布情況，結(jié)構(gòu)以主成分構(gòu)建得分的形式呈現(xiàn)，3組間區(qū)分良好（R2X=0.661，Q2=0.613），ICP和AHP組有部分重疊（圖2）。

圖2 3組間膽汁酸PCA-X得分圖Figure 2 PCA-X score of bile acids among the three groups

為了更好地區(qū)分ICP 組和AHP 組，我們使用OPLS-DA 分析。OPLS-DA 模型較PCA 模型對于組間的判別更優(yōu)，特別適用于尋找兩組之間的差異性代謝物。利用該模型可以看出ICP組和AHP組有更明顯的分離趨勢。模型參數(shù)R2代表模型的解釋能力，Q2代表模型對新數(shù)據(jù)的預(yù)測能力，這兩個(gè)值＞0.5 為好，越接近1 越好。該模型R2=0.587，Q2=0.516（圖3）。

圖3 ICP組和AHP組OPLS-DA得分圖Figure 3 OPLS-DA score of ICP group and AHP Group

置換檢驗(yàn)（permutation test）用于評估OPLS-DA模型擬合度，經(jīng)過200 次置換檢驗(yàn)，得到的R2=0.050，Q2=-0.151，截距值很低，表明該模型無過度擬合現(xiàn)象（圖4）。

圖4 OPLS-DA模型穩(wěn)定性置換檢驗(yàn)Figure 4 Permutation test for stability of OPLS-DA model

2.5 篩選ICP組和AHP組差異性的膽汁酸

對于OPLS-DA模型，采用變量權(quán)重（variable importance in projection，VIP）值代表變量對模型多組間區(qū)分的貢獻(xiàn)。VIP 值越大，變量對于模型組間的區(qū)分越有意義，一般采用VIP 值大于1 作為判別標(biāo)準(zhǔn)。通過對15 種膽汁酸VIP 值進(jìn)行排序后發(fā)現(xiàn)，ICP組和AHP組間的差異性膽汁酸為TCA、TCDCA、GCA、GCDCA和TUDCA（圖5A）。通過S-PLOT的預(yù)測曲線，選取兩端最外側(cè)的變量，得到的差異性膽汁酸和VIP值篩選出的結(jié)果一致（圖5B）。

圖5 VIP排序直方圖（A）和S-PLOT預(yù)測曲線（B）Figure 5 VIP sort histogram（A）and S-plot prediction curve（B）

2.6 ICP與AHP鑒別診斷的ROC分析

結(jié)合OPLS-DA 模型VIP 值篩選出的差異性膽汁酸進(jìn)行ROC分析，繪制診斷ICP與AHP的ROC曲線（圖6），并探討差異性膽汁酸的曲線下面積（area under curve，AUC）及在cut-off 值的靈敏度與特異度。其中TCA 的診斷效能最高，AUC=0.808，當(dāng)cutoff 值為6.996 μmol/L 時(shí)，其診斷ICP 的靈敏度為79.2%、特異度為80.0%。TUDCA 的診斷效能較差，AUC=0.614。進(jìn)一步探討利用差異性膽汁酸聯(lián)合鑒別診斷ICP和AHP的價(jià)值，利用Logistic 回歸分析篩選出TCA、TCDCA、GCA、GCDCA 和TUDCA 組成的聯(lián)合指標(biāo)，其診斷ICP 的效能進(jìn)一步提高，AUC=0.967，靈敏度為90.6%，特異度為98.0%（表4）。

表4 差異性膽汁酸的診斷效能Table 4 Diagnostic efficacy of differential bile acids

圖6 差異性膽汁酸的ROC曲線Figure 6 ROC curve of differential bile acids

3 討論

膽汁酸是由肝臟中的膽固醇合成的。作為生理性的清潔劑分子，具有很高的細(xì)胞毒性。它們經(jīng)歷腸肝循環(huán)，其發(fā)揮的重要作用主要體現(xiàn)在促進(jìn)膽汁分泌內(nèi)源性代謝物以及促進(jìn)膳食脂肪和脂溶性維生素的腸道吸收。主要膽汁酸CA 和CDCA 是肝臟膽固醇代謝的最終產(chǎn)物，是膽固醇排泄的主要途徑。合成后，CA 和CDCA 與?；撬峄蚋拾彼幔s1∶3）偶聯(lián)，然后通過小管膜輸出進(jìn)入膽汁。在回腸末端和結(jié)腸中，CA 和CDCA 經(jīng)過細(xì)菌修飾，主要是去卷曲作用和7-α-脫羥基作用，分別形成次級膽汁酸DCA 和LCA。UDCA 是一種三級膽汁酸，因?yàn)樗羌?xì)菌修飾的結(jié)果，隨后在肝臟代謝。通常在正常血清中可以檢測到微量UDCA。膽汁酸在末端回腸被重新吸收，然后進(jìn)入門靜脈轉(zhuǎn)運(yùn)回肝臟。腸-肝循環(huán)效率很高，95%的膽汁酸被重新吸收［12］。本研究發(fā)現(xiàn)ICP 孕婦和AHP 孕婦與健康孕婦的15 種膽汁酸相比有顯著不同，ICP 和AHP 孕婦的甘氨酸和牛磺酸結(jié)合型膽汁酸濃度明顯高于正常產(chǎn)婦。在初級膽汁酸中CA及其結(jié)合物含量最高，其次是CDCA和DCA，游離和結(jié)合態(tài)UDCA含量較低，而LCA種類含量最低。LCA作為疏水性最強(qiáng)的膽汁酸，細(xì)胞毒性最大，國內(nèi)外都有報(bào)道LCA對ICP診斷的臨床價(jià)值［13］。但是本研究并未發(fā)現(xiàn)三者間有很明顯的濃度差異?？赡芘c檢測方法以及樣本數(shù)量的差異有關(guān)。

ICP中過多的膽汁酸通過胎盤途徑可能與胎兒宮內(nèi)死亡有關(guān)，因?yàn)樗T導(dǎo)了胎盤的氧化應(yīng)激并損害了胎兒心肌細(xì)胞功能［14］。膽汁酸，尤其是CA，在體外可引起人胎盤絨毛靜脈血管收縮和臍帶靜脈收縮。此外，TCA 已被證明可以減少大鼠心肌細(xì)胞的收縮，從而導(dǎo)致同步搏動(dòng)的喪失［15］。本研究也發(fā)現(xiàn)ICP 和AHP 組中TCA 的含量相較于其他膽汁酸，明顯高于正常妊娠組，這和ICP 膽汁酸的致病機(jī)制高度相關(guān)。

目前對AHP的認(rèn)知非常有限，發(fā)病機(jī)制也并不清楚，臨床區(qū)分ICP 和AHP 通常是根據(jù)孕婦是否有皮膚瘙癢癥狀和/或肝功能異常，皮膚瘙癢是主觀癥狀，受心理因素、個(gè)人體質(zhì)以及季節(jié)等影響。實(shí)驗(yàn)室診斷方面僅僅通過TBA增高很難將其與ICP很好地區(qū)分，往往將其誤診為ICP［16］。既往文獻(xiàn)報(bào)道中，有很多關(guān)于ICP 妊娠結(jié)局的研究［17］，關(guān)于AHP 的妊娠結(jié)局研究并不多見。本研究發(fā)現(xiàn)AHP 的妊娠結(jié)局和ICP 之間存在差異，尤其在是羊水糞染率和新生兒轉(zhuǎn)NICU 率兩個(gè)方面，AHP 的妊娠結(jié)局優(yōu)于ICP。同時(shí)發(fā)現(xiàn)AHP 相對正常妊娠，醫(yī)源性早產(chǎn)率明顯增加。這可能是由于臨床對AHP認(rèn)知不足，以及診斷錯(cuò)誤造成的。因此如何找到合適的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)區(qū)分兩者顯得尤為必要［18］。本研究通過建立OPLS-DA 模型，尋找到了兩者之間差異性的膽汁酸，并通過構(gòu)建ROC 曲線，驗(yàn)證了診斷效能。TCA應(yīng)該是兩者之間鑒別診斷的一個(gè)很好的標(biāo)志物，通過進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)如果能夠聯(lián)合兩者之間的差異性膽汁酸（TCA、TCDCA、GCA、GCDA、TUDCA）構(gòu)成聯(lián)合指標(biāo)，診斷效能可以進(jìn)一步提高，為今后更好地診斷這兩種疾病提供了新方法。

膽汁酸譜的研究，并不只局限于找尋ICP 和AHP之間差異性的膽汁酸，對用藥后的療效觀察也有重要意義。優(yōu)思弗（熊脫氧膽酸）是目前臨床治療ICP 的常見藥物［19］，以往只能通過觀察TBA 的降低來判斷療效，但是如果可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測UDCA，對于TBA 下降并不明顯的患者，可能起到更好的療效觀察作用，這一部分研究需要進(jìn)一步開展。鑒于時(shí)間和樣本量的局限性，今后還需增加大樣本進(jìn)行多中心研究進(jìn)一步驗(yàn)證。