馬文杰，洪 牮，朱夢琳，孫 燕，錢麗君，王 凱，李鐘鳴，劉先玲，許 迪*

1南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院老年醫(yī)學科，江蘇 南京 210029；2江蘇省中醫(yī)院超聲醫(yī)學科，江蘇 南京 210029

隨著經(jīng)濟的發(fā)展、生活水平的提高及老齡化社會的到來，心血管疾病的發(fā)病率日益上升，心肌纖維化是心血管疾病的一個重要病理特征，最終可引起心功能不全等一系列嚴重病理損害，甚至導致死亡［1］。

細胞外基質(zhì)沉積是心肌纖維化的主要病理特征，以往心肌纖維化的研究熱點是膠原蛋白，然而除膠原蛋白外，透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）也被認為是細胞外基質(zhì)的重要成分。HA是一種自然形成的多聚糖，廣泛分布于生物體內(nèi)，由透明質(zhì)酸合成酶合成［2］。研究顯示纖維化組織中HA明顯增多，因此HA 被認為是心肌纖維化的特征之一，作為心肌纖維化的產(chǎn)物，被動參與纖維化的發(fā)生發(fā)展［3］。近年來隨著對HA 研究的進一步深入，尤其是一些研究證實HA 不僅是纖維化的產(chǎn)物，更是作為纖維化的驅(qū)動因子，促進成纖維細胞的分化與增殖，主動參與心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展［4-6］。上述研究發(fā)現(xiàn)，HA 根據(jù)其不同的分子量而具有不同的功能，目前HA大致可分為3種［7］。初始合成的HA稱為高分子量透明質(zhì)酸（high molecular weight hyaluronic acid，HMW-HA）（＞1 000 kDa），在生理狀態(tài)下HA 以HMW-HA 形式存在，在炎癥刺激或病理狀態(tài)下，HMW-HA 在透明質(zhì)酸酶作用下會降解為低分子量透明質(zhì)酸（low molecular weight hyaluronic acid，LMW-HA）（6～20 kDa），后者是一種有生物活性的片段［8-10］。研究證實HMW-HA 具有抗炎作用，保護細胞；LMW-HA 則有致炎作用，促進細胞增殖及分化［9，11］。

研究表明LMW-HA 在細胞表面的特異性受體為CD44，其廣泛分布于包括成纖維細胞在內(nèi)的多種細胞中［12］。在白細胞中，CD44 與LMW-HA 結(jié)合后僅15 min 即被覆蓋到細胞的一極，同時HA 進入細胞內(nèi)［9］。LMW-HA 與其受體CD44 相結(jié)合后在調(diào)控細胞增殖等方面起非常重要的作用［13-14］，多項研究表明CD44 與LMW-HA 相互結(jié)合后可參與肺、肝臟及腎臟組織的纖維化病理進程中。細胞膜表面的CD44 在膜相關金屬蛋白酶（membrane-associated metalloprotease，MMP）作用下可以被水解，胞外段向血漿和細胞外液釋放，而胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域則被剪切下，通過核膜進入細胞核內(nèi)，發(fā)揮相應的功能。近幾年對核型CD44 的研究主要集中在腫瘤干細胞領域［15］，研究提示當CD44 轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)時可啟動下游信號，使得細胞發(fā)生程序重調(diào)，從而調(diào)控細胞分化與增殖［13，16-17］。

S100A4蛋白是S100家族的一員，又稱成纖維細胞特異性蛋白1，是器官纖維化的分子標志物，主要參與細胞的分化和增殖［18］。在腫瘤、肺、腎臟、肝臟及心臟纖維化組織中明顯表達，但具體機制不明［19-20］。本課題組前期研究顯示，缺氧刺激乳大鼠成纖維細胞及心梗小鼠模型中發(fā)現(xiàn)α-SMA、S100A4、β-catenin、Collegen 1和Collegen 3表達水平明顯增高。而在心梗組小鼠心肌注射病毒轉(zhuǎn)染S100A4 敲低基因后，Masson 染色提示膠原成分減少，超聲心動圖提示小鼠心功能明顯改善［21-22］。上述實驗進一步證實了S100A4 在心肌纖維化發(fā)生發(fā)展過程中起到非常重要的作用。

LMW-HA 與CD44 結(jié)合后可以調(diào)控細胞增殖，同時也已證明S100A4與心肌纖維化有關，因此我們提出假設：LMW-HA 能夠通過CD44 作用于S100A4蛋白，使其進入細胞核內(nèi)，從而啟動下游信號通路參與心臟纖維化。

本研究旨在證明LMW-HA 作為心肌纖維化的驅(qū)動因子，能促進小鼠心臟成纖維細胞（cardiac fibroblasts，CF）的分化與增殖，并明確其與細胞膜表面受體CD44 結(jié)合后，能夠誘導S100A4 蛋白從胞漿進入細胞核內(nèi)，最終促進心臟纖維化的發(fā)生，為針對HA和CD44的分子靶向治療奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

LMW-HA HA60K-1（Lifecore 公司，美國）；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰酶、BSA（Gibco 公司，美國）；RIPA 裂解液、PMSF、DEPC水、DAPI染色液、抗熒光猝滅封片液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒（杭州碧云天公司）；青霉素-鏈霉素混合物（HyClone公司，美國）；Ⅱ型膠原酶（Worthington 公司，美國）；封閉用羊血清（北京中杉金橋）；CCK-8細胞增殖-毒性檢測試劑盒（DOJINDO 公司，日本）；抗HistoneH3、抗α-SMA（CST 公司，美國），抗CD44（Abcam公司，美國），BRIC-235（ARP公司，美國），抗Collagen 3（上海Proteintech 公司），抗GAPDH、抗S100A4、山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗小鼠IgG-HRP（合肥Biosharp 公司），AlexaFluor 488標記的羊抗兔IgG、AlexaFluor 594 標記的羊抗小鼠IgG（Jackson ImmunoResearch 公司，美國）；HiScriptⅢRT Super Mix for QPCR、Cham QSYBR qPCR Master Mix（上海諾唯贊公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞分離與培養(yǎng)

CF 和心肌細胞（myocardial cell，MC）從南京醫(yī)科大學實驗動物中心提供的出生1～3 d 的SPF 級ICR 乳小鼠的心臟中分離，本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學實驗動物福利倫理委員會批準。分離出的細胞在含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度為37 ℃、CO2為5%。使用0.25%的胰酶進行消化傳代，細胞傳至第3代后隨機分組，用于實驗。

1.2.2 LMW-HA刺激

將LMW-HA 溶于10% FBS 的DMEM 高糖培養(yǎng)基中混勻，CF 用無血清的培養(yǎng)基饑餓過夜后，換成含有LMW-HA的培養(yǎng)基。

1.2.3 CD44抑制劑處理

將CD44抑制劑BRIC-235提前24 h加入培養(yǎng)皿中，37 ℃、5%CO2孵育24 h 后換成含有LMW-HA 的培養(yǎng)基。

1.2.4 CCK-8細胞增殖實驗

用胰酶將CF 消化后進行細胞計數(shù)，在96 孔板中按照每孔100 μL 3 000個細胞的密度加入細胞懸液，CF貼壁后加入LMW-HA 刺激，一定時間后換成普通培養(yǎng)基繼續(xù)孵育。向每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)孵育1 h 后用酶標儀測定450 nm 處吸光度。

1.2.5 Western blot檢測

針對細胞總蛋白，收取細胞并且冰上裂解，孵育15 min，刮下蛋白后4 ℃12 000g離心20 min，收集上清液；使用試劑盒分別提取細胞漿蛋白與核蛋白。應用BCA 法測定蛋白濃度，等量蛋白經(jīng)SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下5%BSA封閉1 h后，一抗4 ℃搖床孵育過夜。第2天二抗孵育2 h，使用ECL 高敏化學發(fā)光試劑檢測目的蛋白的表達。

1.2.6 實時定量PCR（qRT-PCR）檢測

收取細胞并用TRIzol 法提取mRNA，用試劑盒對總mRNA 進行逆轉(zhuǎn)錄（37 ℃15 min，85 ℃5 s）合成cDNA。用SYBRGreen 法進行qRT-PCR 檢測，95 ℃預變性30 s，95 ℃10 s、60 ℃30 s共40個循環(huán)，最后退火。采用StepOne Plus實時PCR系統(tǒng)進行分析。

1.2.7 免疫熒光檢測

CF 傳代至共聚焦培養(yǎng)皿中，37 ℃5%CO2孵育過夜。第2 天用4%多聚甲醛固定30 min，0.3%Triton X-100破膜15 min，5%NGS室溫封閉1 h，加入一抗4 ℃搖床過夜。第2天吸棄一抗，全程避光，熒光二抗室溫孵育1 h，吸棄二抗，DAPI染核6 min，封片，使用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法

每組數(shù)據(jù)均來自3 次獨立的實驗，所有統(tǒng)計分析均使用SPSS25.0進行。正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用雙尾未配對t檢驗，多重比較采用單因素方差分析和Tukey檢驗，所有結(jié)果均使用GraphPad Prism 8.0表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CD44與S100A4在CF中高表達

首先檢測ICR 乳小鼠CF 和MC 中CD44 和S100A4 mRNA 和蛋白的表達。qRT-PCR 對CD44和S100A4 mRNA 進行定量分析（圖1A、B），Western blot 對兩者的蛋白進行定量分析（圖1C～E）。結(jié)果表明，CF 中CD44 和S100A4 的表達量均顯著高于MC（P＜0.01）。

圖1 CD44與S100A4在乳小鼠CF與MC中的表達Figure 1 Expressions of CD44 and S100A4 in neonatal mice CF and MC

2.2 LMW-HA刺激的最佳濃度

CCK-8細胞增殖實驗顯示（圖2A），分別用不同濃度的LMW-HA 刺激CF，當濃度≥0.2 mg/mL 時CF的增殖與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），0.8 mg/mL LMW-HA 作用下，CF 的增殖最明顯。EdU 染色法同樣證明了0.2 mg/mL 的LMW-HA 已經(jīng)開始對CF的增殖產(chǎn)生影響（圖2B）。因此，后續(xù)實驗采用0.8 mg/mL的LMW-HA對CF進行刺激并培養(yǎng)。

圖2 不同濃度的LMW-HA刺激CF的增殖情況Figure 2 The proliferation of CF stimulated by different concentrations of LMW-HA

2.3 LMW-HA刺激后CF的表型轉(zhuǎn)化

PCR 和Western blot 顯示，CF 中的心肌纖維化標志物α-SMA和Collagen 3的表達在LMW-HA刺激8 h 時開始增加，刺激12 h 時顯著增加（P＜0.01）；CD44 mRNA 和蛋白的表達不隨時間變化（P＞0.05）；LMW-HA刺激8 h后S100A4 mRNA和蛋白表達時開始緩慢增加（P＜0.05），刺激12 h后顯著增加（P＜0.01，圖3A、B）。采用α-SMA和S100A4細胞免疫熒光染色觀察到，CF 在LMW-HA 的作用下向肌成纖維細胞分化（圖3C）。

圖3 LMW-HA刺激后心肌纖維化標志物與CD44的表達量變化Figure 3 The expressions of myocardial fibrosis markers and CD44 after LMW-HA stimulation

2.4 LMW-HA 刺 激使CD44 與S100A4 蛋白從胞漿進入胞核

為了研究CD44與S100A4蛋白是否從胞漿進入胞核，對細胞漿蛋白與核蛋白進行分離，然后通過Western blot 證明，LMW-HA 刺激僅15 min 后，胞漿中的CD44 蛋白表達量即開始降低（圖4A），同時胞核中的CD44 蛋白逐漸增加（P＜0.05，圖4B），而S100A4 蛋白在30 min 后的變化才有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結(jié)合總蛋白的表達，可以得出CD44 蛋白從胞漿進入了胞核，而S100A4核蛋白雖然也在合成，但是主要來源于胞漿。免疫熒光結(jié)果也能印證這2個蛋白的核轉(zhuǎn)移（圖4C）。

圖4 LMW-HA刺激對CD44與S100A4蛋白核轉(zhuǎn)移的影響Figure 4 Effects of LMW-HA stimulation on nuclear translocation of CD44 and S100A4 proteins

2.5 CD44 抑制劑存在時LMW-HA 刺激后CF 的表型轉(zhuǎn)化

PCR和Western blot結(jié)果均顯示，BRIC-235本身對細胞無影響，不會導致CF中的心臟纖維化標志物的增加（P＞0.05，圖5）。同時LMW-HA的刺激纖維化作用被逆轉(zhuǎn)，α-SMA、Collagen 3和S100A4的表達不增加，CD44的表達依然不變（P＞0.05）。

圖5 BRIC-235對成纖維細胞中心肌纖維化標志物及S100A4表達的影響Figure 5 Effects of BRIC-235 on expressions of myocardial fibrosis markers and S100A4

2.6 BRIC-235 能抑制CD44 與S100A4 蛋白從胞漿進入胞核的過程

Western blot 結(jié)果顯示，BRIC-235 預處理細胞24 h，無論是否有LMW-HA的存在，胞漿和胞核中的CD44 和S100A4 蛋白的表達量均沒有改變（P＞0.05，圖6A、B）。免疫熒光結(jié)果也證明了其對CD44和S100A4蛋白核轉(zhuǎn)移的抑制作用（圖6C）。

3 討論

心肌纖維化是眾多心血管疾病及心臟老化的一個重要的病理特征，導致的心室重構(gòu)會嚴重影響心功能，目前藥物治療主要圍繞阻斷神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)抑制心室重構(gòu)來展開［23］，已知血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑均有逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的作用，但其確切效果并不佳；此外，干細胞移植和基因治療研究正在逐步深入，但療效尚不確切［24］。因此尋找抑制心肌纖維化逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的新靶點迫在眉睫。

近年來細胞微環(huán)境的作用頗受關注。HA 是細胞外基質(zhì)的重要組成成分，本研究首先明確相較于MC，CF 中的CD44 與S100A4 高表達，因此選擇CF作為研究對象。接著，本研究發(fā)現(xiàn)LMW-HA可促進CF 的表型轉(zhuǎn)化，刺激8 h 后開始分化為肌成纖維細胞，促進心肌纖維化。進一步研究提示，LMW-HA刺激CF后1 h，細胞核內(nèi)的S100A4明顯增多同時胞漿內(nèi)的S100A4減少，并且細胞膜表面的特異性受體CD44 也有此種趨勢。我們根據(jù)以上結(jié)果推測，LMW-HA 促進CF 纖維化的機制可能與CD44 的結(jié)合及S100A4的核轉(zhuǎn)移相關。最后為明確該假設，本研究使用了CD44 抑制劑BRIC-235 重復上述實驗，發(fā)現(xiàn)CF 向肌成纖維細胞表型的轉(zhuǎn)化被抑制，同時CD44 與S100A4 的核轉(zhuǎn)移也未發(fā)生，表明LMW-HA促進CF 纖維化的機制是與CD44 結(jié)合并介導S100A4的核轉(zhuǎn)移。

CD44 是表觀分子量85 kDa 的細胞膜糖蛋白，其結(jié)構(gòu)類似于選擇蛋白，其細胞外部分包含N 端二硫鍵結(jié)合的結(jié)構(gòu)域和O 端糖基化的結(jié)構(gòu)域。CD44是HA 的主要細胞表面受體，其COOH 末端的52 個氨基酸對HA 與CD44 細胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合至關重要［25］。BRIC-235 作為CD44 的特異性抗體，可抑制HA與CD44的結(jié)合［26］。因此，BRIC-235具有作為心肌纖維化靶向治療的潛力，可以阻斷LMW-HA 與CD44的結(jié)合，抑制CF向肌成纖維細胞分化。

本研究一方面創(chuàng)新性地提出HA作為細胞外基質(zhì)的重要組成成分，不僅是心肌纖維化的產(chǎn)物，更是作為纖維化的驅(qū)動因子，促進成纖維細胞的分化與增殖，主動參與到心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展中，為我們更好地理解心肌纖維化的病理機制提供了新思路。另一方面，心肌纖維化的治療一直是心血管疾病治療中的難點，而首次提出LMW-HA/CD44 通過促進S100A4 核轉(zhuǎn)移，與CD44 結(jié)合調(diào)節(jié)下游通路從而促進纖維化的機制，為將來進一步闡述缺血性心肌纖維化分子機制打下了研究基礎，也為今后臨床分子治療提供理論基礎和新的靶點。

然而，本研究依然有需要改進之處。首先，由于條件限制及時間緊張，本研究僅為體外細胞實驗，后續(xù)在體實驗模型并未能實現(xiàn)，未能進一步探討病理狀態(tài)下HA 分解代謝對心功能的影響，以及相關分子治療的安全性和有效性。其次，CD44 與S100A4 在細胞核內(nèi)是通過激活何種下游通路來調(diào)控成纖維細胞的增殖，目前在心肌纖維化的領域尚無定論，需要更深入的研究。

綜上所述，LMW-HA 具有高度致炎作用，而其與成纖維細胞膜特異性受體CD44結(jié)合后進一步形成了纖維化的驅(qū)動力，通過誘導S100A4蛋白向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，促進小鼠成纖維細胞的表型轉(zhuǎn)化從而誘導心肌纖維化的發(fā)生。