陸 敏，盧 偉，楊 勰，孫 穎*

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周科，2南京醫(yī)科大學(xué)江蘇省口腔疾病研究重點實驗室，3江蘇省口腔轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)工程中心，江蘇南京 210029

Wnt 蛋白是一個38～43 kDa 的糖蛋白家族，包含Wnt1、Wnt3a、Wnt7a、Wnt8b等19種成員，由單核/巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌，與炎癥、腫瘤等多種疾病相關(guān)［1］。根據(jù)其激活的信號通路，可分為激活經(jīng)典Wnt信號通路的轉(zhuǎn)化型，如Wnt3a、Wnt7a，以及激活不依賴β-catenin 信號通路的非轉(zhuǎn)化型，如Wnt4、Wnt11。Wnt5a 屬于后者，在胚胎發(fā)育和細(xì)胞生長分化過程中發(fā)揮了重要作用。炎性刺激能促進Wnt5a的產(chǎn)生。在慢性牙周炎患者的牙齦組織中，可檢測到高表達的Wnt5a，牙周致病菌牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）能誘導(dǎo)人單核細(xì)胞系THP-1 表達Wnt5a［2］。但Wnt5a 在牙周炎發(fā)生發(fā)展中的作用，目前尚不完全明確。

中性粒細(xì)胞是宿主抵御牙周致病菌入侵的重要防線，能趨化至細(xì)菌入侵部位，通過吞噬、脫顆粒、呼吸爆發(fā)等機制殺滅細(xì)菌，其數(shù)量過多或活化過度也可能導(dǎo)致功能失調(diào)，釋放過量活性氧（reactive oxygen species，ROS）、膠原酶等產(chǎn)物，導(dǎo)致牙周軟硬組織的破壞［3］。

21 世紀(jì)初，Brinkmann 采用佛波酯（phorbol 12-myristate-13-acetate，PMA）刺激中性粒細(xì)胞，誘導(dǎo)形成了一種被稱為中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular trap，NET）的結(jié)構(gòu)，后者為細(xì)胞向胞外釋放的一種纖維網(wǎng)狀染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，富含大量抗菌肽和酶，包括乳鐵蛋白、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、彈性蛋白酶等。細(xì)菌、病毒、真菌和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-8等細(xì)胞因子均可促進NET的形成，它使死亡的中性粒細(xì)胞也能捕獲并殺滅微生物［4］。

作為一種以自分泌或旁分泌方式產(chǎn)生的效應(yīng)分子，Wnt5a對NET的形成有何影響，這種影響又將如何改變牙周炎的發(fā)生發(fā)展，目前尚不得而知。本研究擬探討Wnt5a對NET形成的調(diào)控作用及可能機制，以期進一步闡明Wnt5a對免疫炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

重組人/小鼠Wnt5a 蛋白（R&D 公司，美國），中性粒細(xì)胞分離劑Polymorphprep（AXIS-SHIELD公司，挪威），大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）O127：B8 LPS 和DCFH-DA（Sigma 公司，美國），P.gingivalisATCC 33277 LPS（InvivoGen 公司，美國），磷脂酰肌醇三激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）（Abcam公司，美國），p-PI3K、AKT、p-AKT、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases1/2，ERK1/2）、p-ERK1/2、絲裂原活化蛋白激酶1/2（mitogen-activated protein kinase1/2，MEK1/2）、p-MEK1/2、PI3K/Akt 抑制劑LY294002、MEK1/2 抑制劑U0126（Cell Signaling 公司，美國），DAPI（杭州碧云天公司），兔抗人MPO多抗、Sytox Green核酸染色劑（Invitrogen公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 人中性粒細(xì)胞的分離

本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有納入研究的志愿者均簽署知情同意書。采集健康志愿者外周靜脈血10 mL，密度梯度離心法常規(guī)分離獲得中性粒細(xì)胞［5］，流式細(xì)胞檢測證實，其純度及活性均高于90%，可用于后續(xù)試驗。健康志愿者的納入標(biāo)準(zhǔn)為：①全身健康，無系統(tǒng)性疾病；②無妊娠、哺乳；③3個月內(nèi)無感冒、發(fā)熱等感染性疾??；④3 個月內(nèi)未服用抗生素、非甾體類抗炎藥或免疫抑制劑；⑤無吸煙史。

1.2.2 NET形成的免疫熒光染色與胞外DNA檢測

將中性粒細(xì)胞以5×105個/孔接種于6 孔板，分為4 組，空白對照組（A 組）、50 ng/mL Wnt5a 組（B組）、1 μg/mLE.coliLPS組（C組）和1 μg/mLP.gingivalisLPS組（D組），每組3個復(fù)孔。刺激3 h后，將各組細(xì)胞接種于預(yù)先涂布聚-L-賴氨酸的玻片上，采用4%多聚甲醛固定，0.2%Triton X-100透化細(xì)胞，隨后加入1∶250 MPO 抗體，4 ℃孵育過夜，采用1∶500 Alexa Fluor 488 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）二抗37 ℃孵育2 h，DAPI 染色2 min，正置熒光顯微鏡下觀察NET的形成。

為對NET進行定量，將中性粒細(xì)胞以5×105個/孔接種于12 孔板，細(xì)胞分為5 組，每組4 個復(fù)孔，A～D組刺激同前，2.5 h 后，加入5 μmol/L DNA 特異性染料Sytox Green，避光孵育30 min，E 組為不添加Sytox Green 染料、無刺激的陰性對照組。采用多功能酶標(biāo)儀SpectraMaxM2e（MD 公司，德國）檢測胞外DNA數(shù)量，發(fā)射波長523 nm，激發(fā)波長504 nm。結(jié)果表示為各組檢測值減去陰性對照組檢測值的差值。

1.2.3 中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)的流式細(xì)胞學(xué)檢測

將中性粒細(xì)胞以5×105個/孔接種于6孔板，A～D組同1.2.2，E 組為不添加DCFH-DA 染料、無刺激的陰性對照組，每組3個復(fù)孔。刺激12 h后，各組加入5 μmol/L DCFH-DA 熒光探針，37 ℃孵育40 min，采用流式細(xì)胞儀FACSCalibur（BD 公司，美國）檢測488 nm波長下的熒光強度，即產(chǎn)生的ROS水平。結(jié)果以刺激組檢測值/空白對照組檢測值表示。

1.2.4 Western blot檢測

中性粒細(xì)胞的分組同1.2.2，刺激30 min 后，常規(guī)裂解細(xì)胞，提取總蛋白，SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，采用PI3K、Akt、MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2 抗體（1∶1 000稀釋）和p-PI3K、p-Akt抗體（1∶500稀釋），4 ℃孵育過夜，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗（1∶5 000 稀釋），孵育2 h，加入ECL 化學(xué)發(fā)光劑，采用Image Quant LAS 4 000 mini 顯影，采用Image J 圖像分析軟件分析各條帶灰度值。

1.2.5 PI3K/Akt、MEK1/2-ERK1/2 對NET 形成的影響檢測

將中性粒細(xì)胞以5×105個/孔接種于12孔板，分為5組，每組4復(fù)孔，A～D組加入50 μmol/L PI3K/Akt抑制劑LY294002 或10 μmol/L MEK1/2、ERK1/2 抑制劑U0126，預(yù)處理30 min后，分別加入空白培養(yǎng)液（A 組）、50 ng/mL Wnt5a（B 組）、1 μg/mLE.coliLPS（C 組）和1 μg/mLP.gingivalisLPS（D 組）。E 組為不加抑制劑、不加Sytox Green、無刺激的陰性對照組。2.5 h 后，檢測NET 形成的胞外DNA 水平，方法同前。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析，組間比較采用Dunnett-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Wnt5a促進NET的形成

免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，未刺激的中性粒細(xì)胞僅形成少量胞外DNA網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。Wnt5a、P.gingivalisLPS或E.coliLPS 刺激后，部分中性粒細(xì)胞核膜解體，染色質(zhì)解聚，形成胞外DNA 纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其中MPO陽性染色為綠色，DAPI 陽性染色為藍(lán)色，表明NET形成（圖1A）。

胞外DNA 的Sytox Green 熒光染色定量分析顯示，與空白對照組相比，Wnt5a、P.gingivalisLPS 或E.coliLPS 刺激后，胞外DNA 數(shù)量明顯增多（P＜0.05），而各刺激組間無明顯差異（P＞0.05，圖1B）。

圖1 Wnt5a促進NET的形成Figure 1 Formation of NET stimulated by Wnt5a

2.2 Wnt5a促進ROS的生成

Wnt5a、P.gingivalisLPS 或E.coliLPS 刺激后，ROS水平均明顯高于未刺激組（P＜0.05），代表性的流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果如圖2A 所示。其中，E.coliLPS 刺激后生成的ROS 數(shù)量明顯高于Wnt5a 和P.gingivalisLPS刺激組（P＜0.05，圖2B）。

圖2 Wnt5a對中性粒細(xì)胞ROS生成的影響Figure 2 Effects of Wnt5a on ROS production in neutrophils

2.3 PI3K/Akt 和MEK1/2-ERK1/2 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對Wnt5a誘導(dǎo)NET形成的影響

Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，Wnt5a 和E.coliLPS 刺激后，中性粒細(xì)胞PI3K、Akt、MEK1/2 和ERK1/2 磷酸化程度均明顯增強（P＜0.05），其中，Wnt5a組ERK1/2磷酸化程度低于E.coliLPS 組（P＜0.05）。P.gingivalisLPS 刺激后，Akt、MEK1/2 和ERK1/2 磷酸化程度比空白對照組強（P＜0.05）。代表性的Western blot 檢測結(jié)果如圖3所示。

圖3 Wnt5a對中性粒細(xì)胞PI3K、Akt、MEK1/2和ERK1/2蛋白磷酸化的影響Figure 3 Effect of Wnt5a on phosphoralation of PI3K，Akt，MEK1/2 and ERK1/2 in neutrophils

為進一步證實PI3k/Akt 和MEK1/2、ERK1/2 磷酸化在Wnt5a 促進NET 形成中的作用，分別采用PI3K/Akt 抑制劑LY294002 和MEK1/2、ERK1/2 抑制劑U0126預(yù)處理中性粒細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與相應(yīng)的無抑制劑組相比，LY294002 和U0126 預(yù)處理后，Wnt5a、P.gingivalisLPS 和E.coliLPS 刺激組中性粒細(xì)胞胞外DNA數(shù)量均明顯減少（P＜0.05，圖4）。

圖4 LY294002/U0126對中性粒細(xì)胞胞外DNA形成的影響Figure 4 Effects of LY294002/U0126 inhibition on extracellular DNA formation

3 討論

Wnt5a 在牙周組織，尤其是炎性牙周組織中的表達已得到證實。Maekawa 等［6］發(fā)現(xiàn)，人牙齦組織中可檢測到Wnt5a和分泌型卷曲相關(guān)蛋白5（secreted frizzled-related protein 5，sFRP5）mRNA。其中，炎癥組織以Wnt5a 表達為主，健康組織以sFRP5 表達為主，采用P.gingivalisLPS刺激人牙齦上皮細(xì)胞后，Wnt5a 表達上調(diào)，sFRP5 表達則下調(diào)。作為一種效應(yīng)分子，Wnt5a 可由巨噬細(xì)胞通過自分泌或者旁分泌方式產(chǎn)生，具有促炎作用，并參與炎癥應(yīng)答［7］。

NET 是中性粒細(xì)胞捕獲、殺滅致病菌的一種重要機制，其過量生成或清除障礙均與炎癥造成的組織破壞相關(guān)［8］。NET 可由多種刺激物誘導(dǎo)形成，如E.coliLPS、IL-8等［9］。P.gingivalisLPS是P.gingivalis的主要毒力因子之一，可直接破壞牙周組織，并引發(fā)多種免疫炎癥反應(yīng)，其結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能與最經(jīng)典的G-菌內(nèi)毒素E.coliLPS相比，存在一定差異［10-11］。因此，本研究選擇P.gingivalisLPS 和E.colLPS 作為陽性對照。Liu 等［12］發(fā)現(xiàn)，在E.coliLPS 介導(dǎo)的小鼠急性肺損傷中可檢測到NET。牙周炎患者牙周袋膿性滲出物及齦溝液中也可檢測到NET，后者能誘捕入侵致病微生物，并限制其傳播［13］。NET同樣可在牙周炎患者的菌斑生物膜及牙周袋上皮中被檢測到［14］。本研究發(fā)現(xiàn)Wnt5a 可促進中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NET，進而可能影響包括牙周組織在內(nèi)的多種組織的免疫炎癥反應(yīng)的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。

NET 的形成主要通過兩種方式，一種是依賴ROS的經(jīng)典途徑，細(xì)胞被激活后1～4 h，細(xì)胞核分裂，核膜分解，細(xì)胞去極化，染色質(zhì)去濃縮，質(zhì)膜破裂，細(xì)胞死亡，釋放出NET；另一種是早期快速、獨立于ROS 的途徑，細(xì)胞被激活后5～60 min，核膜分離，核DNA 和線粒體DNA 以囊泡形式排出胞外，形成NET，細(xì)胞依然存活［8，15］。

中性粒細(xì)胞能產(chǎn)生并釋放大量抗菌肽、蛋白酶及ROS，殺死其捕獲的病原體。ROS包括超氧化物、過氧化氫、羥自由基等，其產(chǎn)生過程被稱為呼吸爆發(fā)。Acquier等［16］研究發(fā)現(xiàn)，侵襲性牙周炎患者唾液中ROS 水平較牙周健康者明顯增高。在中性粒細(xì)胞脫顆粒及NET形成過程中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶產(chǎn)生的ROS 是關(guān)鍵的信號分子［17］。研究發(fā)現(xiàn)，慢性肉芽腫病患者存在NADPH 氧化酶缺陷，難以產(chǎn)生足夠ROS，進而導(dǎo)致DNA 釋放和NET 形成缺陷［17］。研究報道，E.coli和銅綠假單胞菌能通過激活信號分子SAPK/JNK，誘導(dǎo)依賴ROS 的NET 形成［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，Wnt5a、P.gingivalisLPS 和E.coliLPS 均能促進ROS 產(chǎn)生，進而可能影響NET的形成。

PI3K/Akt 和MEK1/2-ERK1/2 通路均受上游信號分子Ras 調(diào)節(jié)。PI3K 包括脂質(zhì)激酶和蛋白激酶，位于Akt 上游，可被磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸通過絲氨酸/蘇氨酸激酶磷酸化激活。PI3K/Akt 廣泛參與了細(xì)胞生長、增殖、代謝、血管生成等過程的調(diào)節(jié)。MEK1/2-ERK1/2 則與細(xì)胞增殖、分化、趨化、ROS形成等功能相關(guān)［19］。抑制PI3K能同時下調(diào)Akt及Raf/MEK/ERK 信號通路［20］。抑制PI3K 后，由PMA及寄生蟲誘導(dǎo)形成的NET也受到顯著抑制［21］。Fonseca 等［22］首先發(fā)現(xiàn)了Raf/MEK/ERK 信號通路在PMA 誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NET 中的作用。Raf/MEK/ERK 信號通路激活后，形成NADPH 氧化酶復(fù)合物，產(chǎn)生ROS，進而導(dǎo)致NET 的形成［23］。本研究發(fā)現(xiàn)，Wnt5a刺激中性粒細(xì)胞后可促進PI3K/AKT及MEK1/2、ERK1/2 磷酸化，PI3K/AKT 抑制劑LY294002 及MEK1/2、ERK1/2抑制劑U0126能抑制NET 生成。因此，推測Wnt5a 誘導(dǎo)NET 形成的過程有PI3K/Akt和MEK1/2、ERK1/2的參與。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Wnt5a 能促進NET 的形成，這一過程可能與ROS 生成增加，以及PI3K/Akt、MEK1/2-ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，對這一過程的調(diào)控可能有助于牙周炎在內(nèi)的炎性疾病的免疫治療。