潘曉嫻，王彩虹，王 锃，陳金梅，2，藍瑞隆，陳俊英，張緯建，2，黃 菲*，洪金省，2*

1福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院放療科，福建 福州 350005；2福建省高等學校放射生物重點實驗室，福建 福州 350005；3福建省腫瘤精準診療重點實驗室，福建 福州 350005；4福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院中心實驗室，福建 福州 350005

胸部腫瘤是臨床上常見的惡性腫瘤，而放射治療是胸部腫瘤綜合治療必不可少的手段，如肺癌、食管癌、縱隔腫瘤等。放射性肺損傷是胸部腫瘤放射治療后常見的不良反應［1］，包括早期的放射性肺炎和晚期的放射性肺纖維化（radiation-induced pulmonary fibrosis，RIPF）［2］。RIPF 一般發(fā)生于胸部放療的6 個月后，臨床表現(xiàn)包括呼吸困難、胸痛，嚴重時可引起呼吸衰竭甚至死亡。目前RIPF 的治療靶標尚不明確，臨床上缺乏有效的治療措施［3］，因此，尋找影響RIPF的靶標對于預防和治療RIPF具有重要意義。

B10 細胞是一種可分泌IL-10 的調(diào)節(jié)性B 細胞（regulatory B cell，Breg）的特殊亞群，參與炎癥、免疫性疾病、腫瘤等多種疾?。?］。近年多項研究證實B10 細胞與多種器官纖維化相關，如病毒引起的肝纖維化［5］、粉塵性肺纖維化［6］、藥物性肺纖維化［7］。然而，粉塵及藥物引起的肺纖維化與電離輻射引起的肺纖維化機制不盡相同。前期研究發(fā)現(xiàn)，給予C57BL/6 小鼠次全身照射可引起脾臟中的Breg細胞亞群增加，抑制自身免疫性疾病的發(fā)展［8］。目前尚無研究報道B10 細胞與RIPF 相關聯(lián)。本研究旨在觀察小鼠經(jīng)胸部電離輻射后，B10 細胞在小鼠RIPF 進程中的動態(tài)變化情況，探討B(tài)10 細胞與RIPF 之間可能存在的關聯(lián)，為RIPF 提供新的防治思路。

1 材料和方法

1.1 材料

直線加速器（Clinac600C/D）（Varian醫(yī)療系統(tǒng)公司，美國），流式細胞儀（Accuri C6）（BD公司，美國）；大鼠抗小鼠CD5-PE（Sigma公司，美國），大鼠抗小鼠CD19-FITC（BioLegend 公司，美國），大鼠抗小鼠CD1d-APC（eBioscience 公司，美國），紅細胞裂解液（BD公司，美國），60 μm細胞篩（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物與分組

選取30 只成年雌性6～8 周齡健康、清潔級C57BL/6 小鼠，體重18～22 g，購自上海斯萊克動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2007-0005。隨機分成5 組，分別為未照射（對照）組、照射后2 d（IR2d）組、照射后14 d（IR14d）組、照射后3個月（IR3m）組，照射后5 個月（IR5m）組，每組6 只。實驗操作符合3R原則，經(jīng)福建醫(yī)科大學倫理委員會批準。

1.2.2 照射方式

配制4%水合氯醛以0.1 mL/10 g 腹腔注射麻醉小鼠。將小鼠放入自制有機玻璃鼠籠中，拉直鼠尾，膠布固定。根據(jù)本單位擺位誤差以及質(zhì)量控制，將照射野設置為38.0 cm×1.5 cm，將固定好的小鼠整齊排列置于治療床上，照射部位為小鼠胸部，具體擺位操作參考已發(fā)表論文［9］。采用直線加速器（Clinac600C/D）用6 MV-X線單次18 Gy照射小鼠全肺，射野角度180°單野照射，劑量率500 Mu/min。通過劑量體積直方圖（dose volume histogram，DVH）評估計算出小鼠肺部百分深度劑量為83%。對照組相同環(huán)境下予以假照射。

1.2.3 標本處理

通過頸椎脫臼法處死各組小鼠，剪取小鼠左側肺組織，浸泡于4%多聚甲醛中固定，24 h 后轉(zhuǎn)至75%酒精，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)0.4 μm 切片，通過HE染色、Masson染色、免疫熒光染色行病理學檢測，顯微鏡下觀察染色情況。另取小鼠整個脾臟及相同質(zhì)量同側肺組織，浸泡于含10%血清的PBS緩沖液中備用，待制備單細胞懸液。

1.2.4 流式細胞樣本處理及流式分析

研磨組織樣本，60 μm 細胞篩過濾脾臟/肺組織，1 800 r/min（脾）、2 000 r/min（肺），離心5 min，棄上清，加入5 mL 紅細胞裂解液重懸后，以相同轉(zhuǎn)速離心3 min 后，棄上清，5 mL PBS 緩沖液洗滌重懸，離心5 mim，去上清，加入100 μL PBS緩沖液制備成單細胞懸液。分別加入0.5 μL大鼠抗小鼠的FITCCD19 抗體、APC-CD1d 抗體和PE-CD5 抗體，混勻，4 ℃下避光孵育30 min。上機，于流式細胞儀上檢測B10細胞數(shù)量占比情況。

1.2.5 病理學評分

Masson染色評分標準：每張切片隨機在上、下、左、右和中部各選1 個視野，根據(jù)Ashcroft 纖維化評分標準對肺纖維化程度進行評分［10］。

免疫熒光評分標準：每張切片在高倍鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)各個視野的陽性細胞數(shù)，采用陽性細胞占視野總細胞數(shù)的百分比來評估表達情況。

1.3 統(tǒng)計學方法

實驗結果采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示。方差齊性檢驗采用F檢驗，對符合正態(tài)分布且方差齊的3組及3組以上的實驗研究數(shù)據(jù)，如各組間B10 細胞比例進行單因素多水平方差分析，進一步使用Dunnett 法（Dunnett’s multiple comparisons test）行多重比較。對于僅有兩組的實驗研究，若變量符合正態(tài)分布，使用雙尾、非配對t檢驗分析組間差異；如變量不符合正態(tài)分布，則使用Mann-WhitneyU檢驗分析組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 病理學驗證C57BL/6小鼠RIPF模型的構建

HE 染色結果顯示，對照組小鼠肺泡結構完整，無炎性細胞浸潤，給予照射后，可見IR2d 組小鼠肺組織出現(xiàn)大量炎性浸潤，如中性粒細胞、巨噬細胞等。IR14d 組炎性滲出有所吸收。IR3m 組出現(xiàn)肺間質(zhì)填充，肺間隔增寬，正常肺結構被破壞。IR5m組發(fā)現(xiàn)肺泡大量融合，肺間隔增寬明顯，肺泡結構破壞顯著（圖1）。肺組織Masson 染色結果示，IR5m組大量膠原纖維填充于肺間質(zhì)中，發(fā)生明顯肺纖維化，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（t′=-6.006，P＜0.001）。免疫熒光染色結果發(fā)現(xiàn)，IR5m 組中肺組織肌成纖維細胞標志物α-平滑肌肌動蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）表達較對照組明顯增加（t=8.022，P＜0.01，圖2）。

圖1 單次18 Gy胸部照射后各時間點的小鼠肺組織HE染色（×100）Figure 1 HE staining of mouse lung tissue at various time points after a single 18 Gy chest irradiation（×100）

圖2 單次18 Gy胸部照射誘導肺纖維化組織的Masson染色及免疫熒光結果Figure 2 Masson staining and immunofluorescence results of lung fibrosis induced by a single 18 Gy chest irradiation

2.2 RIPF進程中肺組織中B10細胞動態(tài)變化情況

胸部照射后，不同時間小鼠肺組織中B10 細胞占全肺細胞比例差異具有統(tǒng)計學意義（F=22.230，P＜0.001）。照射后早期B10細胞浸潤增加，與對照組相比，照射后2 d（P＜0.01）、14 d（P＜0.05）肺組織中B10 細胞明顯增加，而照射后3 個月則較照射后2 d下降明顯（P＜0.05，圖3）。

圖3 電離輻射誘導肺纖維化進程中肺組織B10細胞的浸潤情況Figure 3 Infiltration of B10 cell in lung tissues during the process of radiation-induced pulmonary fibrosis

2.3 RIPF進程中脾臟中B10細胞動態(tài)變化情況

脾組織中，流式細胞計數(shù)結果顯示，照射后不同時間脾臟中B10 細胞占全脾細胞比例不同（F=37.970，P＜0.001）。照射后2 d B10 細胞開始增加，而照射后14 d時則達到峰值（P＜0.001），IR3m組的B10 細胞則較IR2d 組（P＜0.01）、IR14d 組（P＜0.001）明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義（圖4）。

圖4 電離輻射誘導肺纖維化進程中脾臟組織中B10細胞的浸潤情況Figure 4 Infiltration of B10 cells in spleen tissue during the process of radiation-induced pulmonary fibrosis

3 討論

既往研究發(fā)現(xiàn)，Breg 細胞在矽肺或博萊霉素誘導的肺纖維化進程中起重要作用［6-7］，而其亞型B10細胞是否與RIPF 進程關聯(lián)，并且B10 細胞在RIPF中的動態(tài)變化情況，迄今還未見相關報道。本研究通過研究單次18 Gy照射下的RIPF小鼠模型中B10細胞動態(tài)變化情況，首次發(fā)現(xiàn)在電離輻射誘導的小鼠RIPF 進程中，肺組織及脾臟中存在B10 細胞浸潤，且在炎性早期B10細胞比例顯著增加，而在纖維化晚期B10細胞比例逐漸減少。

RIPF 是肺損傷修復的不良結果。電離輻射可引起肺上皮細胞及肺實質(zhì)發(fā)生損傷，在正常愈合過程中，肺泡-毛細血管通透性恢復，炎癥緩解，正常肺受損上皮及實質(zhì)細胞修復。但若肺損傷、炎癥持續(xù)存在，則會持續(xù)調(diào)動機體免疫應答，引起機體肺損傷修復過度導致肺的結構紊亂，最終發(fā)展為不可逆的肺纖維化［11-12］。

B細胞通常被認為能增強免疫反應，然而，B細胞也能抑制多種小鼠自身免疫和炎癥模型的免疫反應［13］。B10 細胞作為一類可產(chǎn)生IL-10 的特殊表型CD19+CD5+CD1d+調(diào)節(jié)性B細胞，發(fā)揮著負調(diào)節(jié)免疫的作用。在免疫應答過程中，炎性分子誘導B10細胞IL-10的產(chǎn)生和效應功能，可抑制抗原特異性T細胞的激活和先天巨噬細胞功能，從而發(fā)揮生物學功能［14］。研究表明，B10 細胞具有強大的調(diào)節(jié)作用，即使少量的B10 細胞也能顯著抑制接觸超敏反應［15］、實驗性自身免疫性腦脊髓炎［16］和移植物抗宿主?。?7］等。此外，近年來，多項研究發(fā)現(xiàn)，B10 細胞與纖維化有關，在多種器官組織的纖維化進程中發(fā)揮重要作用，然而目前對B10 細胞的促纖維化作用和抑制纖維化作用尚有爭議。部分學者認為B10細胞在纖維化進程中起促進作用。研究證明，B10細胞可以通過抑制Th1 反應和調(diào)節(jié)Th 平衡來控制肺部炎癥并加劇矽肺誘導的肺纖維化［6］，Liu等［5］發(fā)現(xiàn)患者外周血的Breg 數(shù)量與肝纖維化程度呈正相關，Komura等［7］提出CD19信號誘導B細胞向肺組織浸潤與博萊霉素誘發(fā)的藥物性肺纖維化有關。而另有一些學者則發(fā)現(xiàn)在類風濕關節(jié)炎相關的肺纖維化中Breg減少［18］。

胸部照射后可誘導多種免疫細胞進入肺內(nèi)。其中，B 淋巴細胞對電離輻射所致的垂死細胞釋放出來的DNA 片段異常敏感，其在照射后可迅速地增殖和分化［19］。在正常小鼠中，大多數(shù)CD19+CD5+CD1d+B10細胞在小鼠脾臟中高度富集，而在其他組織中較少檢測到［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，在肺組織中，未照射對照組的B10 細胞數(shù)量處于較低水平，在照射后2 d、14 d 肺組織中B10 細胞占比明顯增加，且在脾臟中，胸部照射后2 d 也可觀察到B10 細胞增殖，并且在照射后14 d達到峰值，我們推測小鼠接受胸部照射后，B10細胞可能自脾臟募集至肺組織中，參與免疫應答，而小鼠脾臟中B10 細胞則通過增殖分化予以補充。在照射后晚期，脾與肺組織中B10 細胞也相應逐漸減少，這或與小鼠通過自身免疫應答損傷修復，炎癥緩解，肺間質(zhì)重構有關。Cargnoni等［20］發(fā)現(xiàn)可通過減弱B細胞抗原遞呈減輕Treg細胞在博來霉素誘導的肺纖維化的促進作用。Lu 等［21］研究發(fā)現(xiàn)B10細胞可通過釋放IL-10增強Treg功能并促進Treg的轉(zhuǎn)化。Xiong等［22］研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）在小鼠胸部照射后數(shù)量明顯增加，并且進一步發(fā)現(xiàn)Treg細胞可通過調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進RIPF的進程。這提示B10細胞可能通過IL-10的分泌促進其他效應細胞發(fā)揮促RIPF的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)小鼠B10 細胞可能與RIPF 有關，且在RIPF 進程中，小鼠肺組織、脾臟組織中B10 細胞比例在纖維化早期明顯升高，而在纖維化晚期則明顯減少。本研究推測B10細胞可能是影響RIPF重要的免疫細胞。然而，B10細胞促進或抑制RIPF 尚且不明，且機制未清，需進一步深入研究，為抗RIPF研究提供新思路。