曾棋平，楊麗娜，吳坤林，蔡小輝，陳錦珊

(聯(lián)勤保障部隊第九〇九醫(yī)院/廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院藥劑科，福建漳州 363000)

唐代茶圣陸羽曰：“茶，紫者為上”，此處“紫”指鮮茶葉的顏色，主要因富含花青素而呈紫色[1]?？夏醽單挥诜侵迻|部，地處赤道，境內(nèi)海拔1500～2000米，晝夜溫差大且紫外線照射強(qiáng)烈，為紫茶的生長提供了得天獨(dú)厚的條件，產(chǎn)量豐富且品質(zhì)優(yōu)越。紫茶的化學(xué)成分復(fù)雜，包括多酚、氨基酸、碳水化合物、蛋白質(zhì)、揮發(fā)性化合物、礦物質(zhì)、微量元素和生物堿(咖啡因、茶堿、可可堿)等。其中，多酚是主要的生物活性物質(zhì)[2]。多酚類化合物是一類復(fù)雜的具有多個酚羥基的次生代謝產(chǎn)物，主要包括酚酸、黃酮類、木脂素類和單寧等化合物[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，天然植物中含有的多酚具有抗腫瘤[4]、抗氧化[5]、抗纖維化[6]、抗菌[7]等功效，因此成為國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注和研究的熱點(diǎn)。目前，紫茶多酚的質(zhì)量控制方法及抗氧化活性研究尚未見報道。作者采用鐵氰化鉀-氯化鐵比色法測定肯尼亞紫茶中多酚的含量，并對其體外抗氧化活性進(jìn)行初步研究，從而為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 UV-2550型紫外可見分光光度計、AUX220型電子分析天平(精度：0.1 mg)均由日本島津公司提供；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所)；KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 藥品和試劑 紫茶粉(產(chǎn)于非洲肯尼亞， 由火烈鳥茶葉有限公司提供， 批號20181030)； 沒食子酸對照品(中國食品藥品檢定研究院， 批號110831-201605)； 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH， 福州飛凈生物科技有限公司， 批號201806)； 鐵氰化鉀(溫州市化學(xué)用料廠)； 水楊酸(山東新華制藥股份有限公司， 批號16185)； 六水合三氯化鐵、磷酸二氫鉀、三氯乙酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、鹽酸、乙醇等試劑均購自西隴科學(xué)股份有限公司。 以上試劑均為分析純， 水為純化水(聯(lián)勤保障部隊第九〇九醫(yī)院/廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院自制)。

2 方法和結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 紫茶多酚供試品溶液 取紫茶粉末約5.0 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入50%乙醇500 ml，85 ℃水浴回流提取30 min，將提取液過濾，用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量并稀釋至500 ml，搖勻。再精密吸取1 ml置于100 ml量瓶中，加純化水稀釋至刻度，即得紫茶多酚供試品溶液。

2.1.2 沒食子酸對照品溶液 精密稱取干燥至恒重的沒食子酸對照品14.2 mg，置于50 ml量瓶中，加純化水溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取溶液10 ml，置于100 ml量瓶中，制備成質(zhì)量濃度為28.4 μg/ml的沒食子酸對照品溶液。同法制備質(zhì)量濃度為26.0 μg/ml的沒食子酸對照品溶液，避光保存，備用。

2.2 實(shí)驗條件的優(yōu)化

2.2.1 檢測波長的確定 分別精密吸取紫茶多酚供試品溶液和質(zhì)量濃度為28.4 μg/ml的沒食子酸對照品溶液各1.0 ml，置25 ml量瓶中，依次加入0.1 mol/L的FeCl3溶液2.0 ml、1%K3[Fe(CN)6]溶液1.0 ml、0.1 mol/L的HCl溶液2.5 ml，用純化水稀釋至刻度，搖勻，于室溫下避光放置60 min。以相應(yīng)試劑為空白對照，在波長380～900 nm的范圍內(nèi)進(jìn)行掃描(見圖1)，確定最大吸收波長。由圖1可見，沒食子酸對照品溶液和紫茶多酚供試品溶液經(jīng)顯色反應(yīng)后的光譜吸收曲線基本一致，且兩者均在775 nm處有最大吸收峰。因此，選擇775 nm作為紫茶多酚的檢測波長。

圖1 紫茶多酚的紫外掃描光譜圖1：沒食子酸對照品溶液；2：紫茶多酚供試品溶液

2.2.2 FeCl3用量的考察 在室溫條件下，精密吸取紫茶多酚供試品溶液0.5 ml，各6份，分別置25 ml量瓶中，加入1%K3[Fe(CN)6]溶液1.5 ml和0.1 mol/L的HCl溶液2.5 ml，再依次加入0.1 mol/L的FeCl3溶液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 ml，分別用純化水稀釋至刻度，搖勻，避光放置60 min。以相應(yīng)試劑為空白對照，在775 nm處測定吸光度，考察FeCl3用量對顯色效果的影響，結(jié)果見圖2A。由圖2A可見，在考察范圍內(nèi)，隨著FeCl3用量增加，生成可溶性普魯士藍(lán)的量也不斷增加，當(dāng)FeCl3的用量為1.0 ml時，所測樣品的吸光度為0.651，恰好在0.3～0.7范圍內(nèi)，滿足測定需求，因此選擇FeCl3的用量為1.0 ml。

2.2.3 K3[Fe(CN)6]用量的考察 在室溫條件下， 精密吸取6份0.5 ml的紫茶多酚供試品溶液， 置 25 ml 量瓶中， 分別加入 0.1 mol/L的FeCl3溶液1.0 ml和0.1 mol/L的HCl溶液2.5 ml，再依次加入1%K3[Fe(CN)6]溶液0.2、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0和2.5 ml，分別用純化水稀釋至刻度，搖勻，避光放置60 min。以相應(yīng)試劑為空白對照，在775 nm處測定吸光度，確定K3[Fe(CN)6]用量對顯色效果的影響，結(jié)果見圖2B。由圖2B可見，在考察范圍內(nèi)，當(dāng)K3[Fe(CN)6]的用量為2.0 ml時，吸光度已達(dá)到最大，此時繼續(xù)增加K3[Fe(CN)6]，所測溶液的吸光度基本保持不變，表明溶液中生成的普魯士藍(lán)濃度已達(dá)到飽和，因此選擇K3[Fe(CN)6]的用量為2.0 ml。

圖2 檢測試劑用量對顯色效果的影響A：FeCl3；B：K3[Fe(CN)6]；C：HCl

2.2.4 HCl用量的考察 在室溫條件下，精密吸取6份紫茶多酚供試品溶液0.5 ml，分別置25 ml量瓶中， 加入0.1 mol/L的FeCl3溶液1.0 ml和1%K3[Fe(CN)6] 溶液2.0 ml，再依次加入0.1 mol/L的HCl溶液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，分別用純化水稀釋至刻度，搖勻，避光放置60 min。以相應(yīng)試劑為空白對照，在775 nm處測定吸光度，確定HCl用量對顯色效果的影響，結(jié)果見圖2C。由圖2C可見，當(dāng)HCl的用量為0.5 ml時，吸光度最大，故確定HCl的用量為0.5 ml。

2.2.5 反應(yīng)時間的考察 確定0.1 mol/L的FeCl3溶液用量為1.0 ml，1%K3[Fe(CN)6]的用量為2.0 ml，HCl的用量為0.5 ml，考察避光放置時間對顯色效果的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可見，避光放置60 min后吸光度達(dá)到最大，繼續(xù)延長放置時間對吸光度測定影響不大。因此，選擇反應(yīng)時間為60 min。

圖3 反應(yīng)時間對顯色效果的影響

2.3 含量測定方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定 分別精密吸取濃度為28.4 μg/ml的沒食子酸對照品溶液0.2、0.3、0.5、0.8、1.0、1.2 ml，置25 ml量瓶中，依次加入0.1 mol/L的FeCl3溶液1.0 ml、1%K3[Fe(CN)6]溶液2.0 ml和0.1 mol/L的HCl溶液0.5 ml，用純化水稀釋至刻度，搖勻，于室溫下避光放置60 min。以相應(yīng)試劑為空白對照，在775 nm處測定吸光度。以沒食子酸的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，以吸光度(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：y=0.769 9x+0.027 3(r=0.999 7)，表明沒食子酸質(zhì)量濃度在0.227～1.363 μg/ml范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2 精密度試驗 精密吸取28.4 μg/ml的沒食子酸對照品溶液0.8 ml，按2.3.1項下方法進(jìn)行顯色反應(yīng)，測定吸光度。結(jié)果沒食子酸對照品溶液吸光度的RSD=0.15%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取0.5 ml同一紫茶多酚供試品溶液6份，按2.3.1項下方法進(jìn)行顯色反應(yīng)，避光放置60 min后每隔10 min測定一次吸光度，結(jié)果在60～120 min時間范圍內(nèi)，供試品溶液的RSD=1.24%(n=6)，表明在60～120 min內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)物的穩(wěn)定性良好，滿足測定需求。

2.3.4 重復(fù)性試驗 按2.1.1項下方法，平行制備6份供試品溶液，各精密吸取0.5 ml，按2.3.1項下方法進(jìn)行顯色反應(yīng)，測定吸光度。結(jié)果紫茶多酚的平均含量為421.5 mg/g，RSD=1.27%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 回收率試驗 精密吸取紫茶多酚質(zhì)量濃度為42.15 μg/ml的供試品溶液0.25 ml，共6份，分別置25 ml量瓶中，精密加入26.0 μg/ml的沒食子酸對照品溶液0.4 ml，按2.3.1項下方法進(jìn)行顯色反應(yīng)，以相應(yīng)試劑為空白對照，在775 nm處測定吸光度，計算多酚的含量。結(jié)果所測樣品的平均回收率為100.28%，RSD=2.09%(n=6)。

2.4 樣品含量測定 按照2.1.1項下方法配制3批紫茶多酚供試品溶液，分別精密吸取0.5 ml置25 ml量瓶中，依次加入0.1 mol/L的 FeCl3溶液1.0 ml、1%K3[Fe(CN)6]溶液2.0 ml和0.1 mol/L的HCl溶液0.5 ml，用純化水稀釋至刻度，搖勻，于室溫下避光放置60 min。以相應(yīng)試劑為空白對照，在775 nm處測定吸光度，計算紫茶多酚的含量，結(jié)果批號201908221、201908222、201908223的紫茶樣品中多酚的含量分別為(421.5±1.5)、(422.8±2.1)、(422.1±1.2) mg/g(n=3)。

2.5 紫茶多酚抗氧化活性的測定

2.5.1 DPPH自由基清除率 取濃度為1.5、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、20.0 μg/ml的紫茶多酚溶液各2 ml置試管中，分別加入0.2 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液2 ml，充分混勻后避光放置30 min，在517 nm波長處測定吸光度(A1)；以無水乙醇作為空白對照，測定吸光度(A0)；同時以無水乙醇代替DPPH，測定吸光度(A2)。按照下列公式計算：

DPPH自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

以維生素C作為陽性對照，同法測定DPPH自由基清除率，結(jié)果見圖4。由圖4可見，紫茶多酚具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除率，隨著多酚濃度增加，DPPH自由基清除率增加，并呈現(xiàn)濃度依賴性。質(zhì)量濃度在0.75～3.75 μg/ml范圍內(nèi)，紫茶多酚對DPPH自由基的清除能力略強(qiáng)于維生素C；質(zhì)量濃度在5～10 μg/ml范圍內(nèi)，其對DPPH自由基的清除能力則弱于維生素C。分別將紫茶多酚和維生素C的質(zhì)量濃度(x)對DPPH自由基的清除率(y)進(jìn)行回歸分析，得到紫茶多酚在質(zhì)量濃度0.75～6.25 μg/ml范圍內(nèi)的線性回歸方程為：y=11.77x+11.34(r=0.997 0)；對應(yīng)的維生素C的線性回歸方程為：y=14.61x-2.43(r=0.985 4)。從回歸方程求得紫茶多酚清除DPPH自由基的IC50為3.28 μg/ml，維生素C清除DPPH自由基的IC50為3.59 μg/ml。

圖4 紫茶多酚對DPPH自由基的清除率曲線○：紫茶多酚；●：維生素C

2.5.2 羥基自由基清除率 取6 mmol/L的FeSO4溶液1 ml共8份，置試管中，加入10 mmol/L的水楊酸乙醇溶液1 ml，分別加入12.25、24.50、36.75、49.00、61.25、73.50、85.75、98.00 μg/ml的紫茶多酚溶液4 ml，最后加入6 mmol/L的H2O2溶液1 ml，置37 ℃水浴中反應(yīng)0.5 h。在510 nm波長處測定吸光度(A1)，以純化水作為空白對照測定吸光度(A0)，同時以純化水代替水楊酸測定吸光度(A2)，按照下列公式進(jìn)行計算。

羥基自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

以維生素C作為陽性對照，同法測定，結(jié)果見圖5。由圖5可見，紫茶多酚對羥基自由基的清除率呈濃度依賴性。分別將紫茶多酚和維生素C的質(zhì)量濃度(x)對羥基自由基的清除率(y)進(jìn)行回歸分析，得到紫茶多酚在質(zhì)量濃度7～56 μg/ml范圍內(nèi)的線性回歸方程為：y=1.671x-4.088(r=0.991 5)；維生素C在質(zhì)量濃度7～35 μg/ml范圍內(nèi)的線性回歸方程為：y=2.494x+13.640(r=0.979 3)。通過線性回歸方程計算得到紫茶多酚清除羥基自由基的IC50為32.37 μg/ml，維生素C清除羥基自由基的IC50為14.58 μg/ml。從整體上看，在相同質(zhì)量濃度下，紫茶多酚對羥基自由基的清除能力比維生素C更弱。

圖5 紫茶多酚對羥基自由基的清除率曲線○：紫茶多酚；●：維生素C

3 討 論

文獻(xiàn)報道，多酚的含量測定方法有福林酚比色法、高錳酸鉀滴定法、酒石酸亞鐵分光光度法和鐵氰化鉀-氯化鐵比色法等[8]。本研究采用鐵氰化鉀-氯化鐵比色法對紫茶多酚含量進(jìn)行測定，其原理是基于多酚類化合物的酚羥基具有較強(qiáng)的還原性，能將Fe3+還原成Fe2+，F(xiàn)e2+與鐵氰化鉀發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成普魯士藍(lán)沉淀，而該沉淀可在強(qiáng)酸性溶液中溶解。通過單因素考察對實(shí)驗條件進(jìn)行優(yōu)化，確定顯色反應(yīng)的最優(yōu)條件是加入0.1 mol/L 的FeCl31.0 ml、1%K3[Fe(CN)6] 2.0 ml和0.1 mol/L的HCl溶液0.5 ml，反應(yīng)時間為60 min，根據(jù)反應(yīng)后生成的普魯士藍(lán)溶液的吸光度計算紫茶多酚的含量。

多酚類化合物是良好的抗氧化劑，其抗氧化作用與化學(xué)結(jié)構(gòu)中的鄰位酚羥基極易被氧化密切相關(guān)。酚羥基可提供活潑氫，使自由基滅活，而自身被氧化生成含有鄰二酚結(jié)構(gòu)的自由基，具有較高的穩(wěn)定性[9-10]。本研究通過DPPH自由基和羥基自由基清除法評價紫茶多酚的抗氧化活性。結(jié)果表明，在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，紫茶多酚對DPPH自由基和羥基自由基的清除能力呈濃度依賴性。當(dāng)DPPH自由基的質(zhì)量濃度為6.25 μg/ml，羥基自由基的質(zhì)量濃度為56.0 μg/ml時，紫茶多酚對其清除率分別達(dá)到83.17%和83.91%。與維生素C相比，紫茶多酚清除DPPH自由基的IC50更低，而清除羥基自由基的IC50則更高。

綜上所述，本研究建立的紫茶多酚含量測定方法操作簡便，重復(fù)性好，可用于紫茶的質(zhì)量控制。紫茶中的多酚含量較高，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑資源進(jìn)行研究和開發(fā)。