黃仁超，張世文，金從國，周博，趙留芳，王浩，邱有玉，張露，董子辰

650118昆明,昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院 頭頸外一科[黃仁超(現(xiàn)工作單位：661000 云南 紅河，紅河州第三人民醫(yī)院 甲狀腺外科)、張世文、趙留芳、王浩、邱有玉、張露，董子辰] ，腫瘤研究所(金從國); 661000 云南 紅河，紅河州第三人民醫(yī)院 甲狀腺外科(周博)

下咽鱗狀細胞癌是頭頸鱗癌中預后最差的惡性腫瘤之一[1]，約占頭頸部惡性腫瘤的3%～5%[2]，占全身惡性腫瘤的0.5%[3]。由于下咽鱗癌病灶位置隱蔽，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，疾病進展快，盡管包括手術(shù)、放療和化療在內(nèi)的多模式治療取得了一定進展，但5年生存率僅為20%～35%[4]。既往研究發(fā)現(xiàn)，下咽鱗癌常常伴有不同程度的免疫抑制，隨著病情的進展，細胞免疫和體液免疫功能均有所下降[5]。細胞免疫是機體抗腫瘤免疫的主力軍[6]，淋巴細胞和自然殺傷(natural killer，NK)細胞是機體細胞免疫的重要組成部分[7]。機體免疫缺陷常表現(xiàn)為T淋巴細胞水平下降。CD3+代表T細胞總數(shù)、CD4+代表輔助性T淋巴(helper T,Th)細胞、CD8代表抑制性T淋巴(suppressor T,Ts)細胞或細胞毒性T淋巴 (cytotoxic T,Tc)細胞[8]，它們在免疫監(jiān)視、免疫調(diào)節(jié)及殺傷靶細胞方面具有重要作用。正常情況下，T細胞及亞群的數(shù)目處于相對平衡狀態(tài)，免疫功能穩(wěn)定。若T細胞總數(shù)或者CD4+/CD8+T細胞比值發(fā)生異常，即可視為免疫調(diào)節(jié)紊亂，機體免疫功能低下或受抑制，易造成腫瘤的發(fā)生和進展[9]。本文通過研究下咽鱗癌患者治療前機體免疫細胞的分布特征，并對不同免疫狀態(tài)的患者進行生存分析，旨在探討下咽鱗癌患者機體免疫細胞的分布特征及對預后的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2009年11月至2019年10月昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院收治的650例下咽鱗癌患者為研究對象，納入標準：1)原發(fā)于下咽的惡性腫瘤；2)經(jīng)病理證實為鱗狀細胞癌；3)患者均為首次發(fā)病，入院前未經(jīng)治療；4)無其他腫瘤病史；5)影像學資料證實無其他部位原發(fā)惡性腫瘤。排除標準：1)臨床資料記錄不完整；2)患免疫相關疾病者。另選擇此期間內(nèi)來昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院接受體檢的健康者作為對照組， 均無免疫相關疾病。該研究通過了昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院倫理委員會的醫(yī)學倫理審查(倫理編號：QT201905)。

1.2 臨床指標

采集下咽鱗癌患者的治療方式和治療前后的免疫指標[包括T淋巴細胞數(shù)(CD3 +T細胞、CD4 +T細胞、CD8 +T細胞)、NK細胞數(shù)和細胞因子誘導的殺傷(cytokine-induced killer,CIK)細胞數(shù)及病理檢查結(jié)果等資料。另選擇健康者的T淋巴細胞數(shù)作為對照組。

1.3 實驗儀器、試劑及檢測方法

1.3.1 實驗儀器與實驗試劑 CS-3000PLUS血細胞分離機購自百特公司，F(xiàn)orma311二氧化碳孵箱，F(xiàn)orma205生物安全柜，Gibco無血清培養(yǎng)基(AMV)，Beckman Coulter EPICS XL流式細胞儀均購自IMMUNOTECH公司。流式檢測試劑CD326(EpCAM)-PE購自BD公司，CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5、CD3-FITC/CD16+56-PE、CD45-PC5均購自BECKMAN COULTER公司，CK18-FITC購自ABCAM公司。

1.3.2 檢測方法 下咽鱗癌患者的采血時間點為治療開始前第1天和治療結(jié)束后第1天。1)臨床標本采集：抽取清晨空腹靜脈血1 mL，肝素抗凝，充分混勻，避免振蕩；2) T細胞亞群檢測：取試管加入10 μL CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5，加入肝素抗凝的全血100 μL，搖勻后避光室溫靜置30 min。加入NH4CL溶血素2 mL溶血，15 min后上機檢測，CD45+CD3+細胞為CD3細胞、CD45+CD3+CD4+細胞為CD4細胞、CD45+CD3+CD8+細胞為CD8細胞；3) NK及CIK細胞檢測：取試管加入20 μL CD45-PC5、CD3-FITC/CD16+56-PE，加入肝素抗凝的全血100 μL，搖勻后避光室溫靜置30 min,加入NH4Cl溶血素2 mL溶血，15 min后上機檢測，CD45 +CD3-CD16 +56 +細胞為NK細胞，CD45 +CD3 +CD16 +56 +為CIK細胞。

1.4 腫瘤患者免疫細胞特征分類

Jin等[10]通過對12 000例腫瘤患者進行大數(shù)據(jù)分析，把免疫細胞檢測結(jié)果分為5類，即第I類(免疫耐受型)：CD3、CD4、CD8、CD4/CD8比值、NK、CIK均在正常范圍內(nèi)；第II類(免疫低下型)：CD3、CD4、CD8下降，CD4/CD8正常,NK升高，CIK正常；第III類(腫瘤反應型)：CD3正常，CD4明顯下降，CD8明顯升高，CD4/CD8明顯下降，NK和CIK正常；第IV類(免疫消耗型)：CD3、CD4正常，CD8明顯下降，CD4/CD8明顯升高，NK、CIK正常；第V類(免疫亢進型)：CD3升高，CD4正常，CD8明顯升高，CD4/CD8明顯降低，NK下降，CIK正常。

1.5 隨訪情況

采用電話進行隨訪，末次隨訪日期為2019年10月26日，總生存時間(overall survival,OS)指從首次確診時間至患者死亡時間或最后一次有效隨訪時間，失訪患者按死亡處理, 并以最后一次有效隨訪時間計入。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 一般資料

共納入650例下咽鱗癌患者為研究對象。其中男性624例(96%)，女性26例(4%)，年齡40～87歲，中位年齡58歲。腫瘤臨床分期采用國際抗癌聯(lián)盟2010年第七版的腫瘤臨床分期標準：I期26例(4%)，II期26例(4%)，III期39例(6%)，IV期559例(86%)。對照組共納入650例，其中男性533例(82%)，女性117例(18%)，年齡38～79歲，中位年齡52歲。治療上采用化療者286例(44%)，采用放化療者364例(56%)。

2.2 下咽鱗癌組和正常組免疫細胞比較

與對照組相比，下咽鱗癌組CD3 +T細胞、CD4 +T細胞、CD4+/CD8+比值、NK細胞、CIK細胞數(shù)顯著降低，CD8+T細胞顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。

表1 下咽鱗癌組和正常組免疫細胞比較

2.3 下咽鱗癌患者治療前機體免疫細胞的分布特征

650例下咽鱗癌患者治療前免疫細胞的分布特征可分為5種類型，第I類占34%(221/650)；第II類和第III類分別占22%(143/650)和26%(169/650)；第IV類和第V類分別占10%(65/650)和8%(52/650)(表2)。由表2可見，下咽癌的免疫細胞有5種類型，第I類免疫細胞是正常的，第II～V類的免疫細胞是紊亂的，與第I類相比，差異有統(tǒng)計學意義。

表2 下咽鱗癌患者治療前機體外周血免疫細胞的分布特征

2.4 不同治療方式對下咽鱗癌患者治療前后免疫細胞分布的影響

接受化療的286例患者中，免疫細胞特征分布為第I類的患者(65例)化療后CD3+T細胞顯著降低； 第II類 患者(78例)化療后CD3+T細胞顯著降低，CD4+/CD8+比值顯著升高 ； 第III類 患者(65例)化療后CD3+T細胞顯著升高； 第IV類 患者(39例)化療后CD3+T細胞、CD4+/CD8+比值顯著降低； 第V類(39例) 患者化療后CD3+T細胞顯著降低(P<0.05)；接受放化療的364例患者中，免疫細胞特征分布為第I類的患者(156例)放化療后CD3+T細胞、CD4+/CD8+比值顯著降低； 第II類患者(65例)放化療后CD3 +T細胞、CD4 +/CD8+比值顯著降低；第III類患者(104例)放化療后CD4+/CD8+比值顯著升高； 第IV類患者(26例)放化療后CD3+T細胞、CD4+/CD8+比值顯著降低；第V類患者(13例)放化療后CD3+T細胞顯著降低、CD4+/CD8+比值顯著升高(表3)。

表3 不同治療方式對下咽鱗癌患者治療前后免疫細胞分布的影響

(Table 3 continues on next page)

2.5 不同免疫狀態(tài)的下咽鱗癌患者生存分析

免疫細胞特征分布為第I～V類的650例下咽鱗癌患者的12月、24月和36月的總生存率(overall survival rate,OSR)分別為71.00%、49.00%、91.70%、78.00%、74.80%和22.80%、14.30%、66.10%、57.00%、44.90%和10.60%、0、37.20%、28.60%、14.30%，相互間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(表4)。

表4 下咽鱗癌患者在不同免疫狀態(tài)下的總生存率

單純化療組和放化療組12月、24月和36月的OSR分別為62.1%、33.4%、13.3%和81.1%、41.7%、22.5%，差異有統(tǒng)計學意義(表5)。

表5 治療方式對下咽鱗癌患者生存期的影響

單純化療組中免疫細胞特征分布為第I～V類的286例下咽鱗癌患者的中位生存期分別為9個月、10個月、32個月、22個月、23個月，差異有統(tǒng)計學意義(表6)。

表6 不同免疫狀態(tài)下單純化療對下咽鱗癌患者生存期的影響

放化療組中免疫細胞特征分布為第I～V類的364例下咽鱗癌患者的中位生存期分別為16個月、11個月、32個月、29個月、23個月，差異有統(tǒng)計學意義(表7)。

表7 不同免疫狀態(tài)下放化療對下咽鱗癌患者生存期的影響

各組患者生存曲線圖見圖1～4。

圖1 免疫細胞分類對下咽鱗癌患者生存期的影響

圖2 治療方式對下咽鱗癌患者生存期的影響

圖3 不同免疫狀態(tài)下單純化療對下咽鱗癌患者生存期的影響

圖4 不同免疫狀態(tài)下放化療對下咽鱗癌患者生存期的影響

3 討 論

免疫功能的改變常與腫瘤形成相關，大量的動物模型證據(jù)支持自身免疫異常可能促進腫瘤生長的觀點[11]。相關研究證明，下咽鱗癌患者機體內(nèi)免疫功能明顯下降, Th細胞減少，Ts細胞增多, 機體出現(xiàn)免疫抑制[12]。以細胞免疫為主的腫瘤免疫是導致腫瘤發(fā)生免疫逃避以及免疫抑制的主要原因[13-14]。細胞免疫以T淋巴細胞介導的特異性免疫最為關鍵[7]。外周血T 細胞亞群活性變化情況能夠較好地反映患者機體細胞免疫功能狀態(tài)[15]，免疫功能狀態(tài)越差的患者生存情況越差[16]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，下咽鱗癌患者機體內(nèi)存在細胞免疫功能紊亂，這可能是促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的原因之一。

Jin等[10]通過對12 000例腫瘤患者進行大數(shù)據(jù)分析，把免疫細胞檢測結(jié)果分為5類，其中第I類為免疫耐受型，免疫細胞值均在正常范圍內(nèi)，免疫細胞中的效應細胞對腫瘤無反應性；第II類為免疫功能低下型，主要表現(xiàn)為患者CD3+T細胞總數(shù)降低，機體體質(zhì)差，免疫力低下；第III類為腫瘤反應型，主要表現(xiàn)為CD4+/CD8+比值降低，此類型降低腫瘤負荷可使免疫細胞水平恢復正常；第IV類為機體反應不足，效應細胞耗竭型，主要表現(xiàn)為CD4+/CD8+比值升高，CD8+效應細胞消耗過快，機體反應性差；第V類為免疫細胞亢進型。主要表現(xiàn)為CD3+T細胞總數(shù)升高，體液免疫亢進，機體反應性好，腫瘤反應性差。這一分類方法在肺癌免疫細胞的分類中已得到了應用[10]。

Das等[17]的研究表明，CD3+總T細胞、CD4+/CD8+比值可以較好地反映免疫調(diào)節(jié)的平衡性，且CD4+/CD8+比值降低提示患者的免疫功能降低而增加惡性腫瘤發(fā)生的機會。我們的研究發(fā)現(xiàn)，免疫細胞特征分布為第III類的下咽鱗癌患者單純化療后CD3+T細胞顯著升高，放化療后CD4+/CD8+比值顯著升高，無論是單純化療還是放化療，免疫細胞特征分布為第III類的患者治療后免疫細胞的改善均較為顯著。越來越多的證據(jù)表明，在宿主免疫系統(tǒng)和化療之間存在著一種復雜的相互作用。通常情況下，化療藥物引起惡性腫瘤細胞死亡后，腫瘤細胞抗原會進入宿主免疫系統(tǒng)，導致T細胞介導的腫瘤特異性免疫應答[18]。傳統(tǒng)理論一直認為放療是通過損傷腫瘤的DNA而殺滅腫瘤細胞，然而后期研究表明, 放療可以通過影響特定的免疫調(diào)節(jié)機制來發(fā)揮抗腫瘤作用[19]。我們的研究同時發(fā)現(xiàn)，無論是單純化療還是放化療，均是免疫細胞特征分布為第III類的下咽鱗癌患者中位生存期最長，預后最好，我們考慮可能與免疫細胞分布為第III類的患者治療后免疫細胞改善均較為顯著有關。本研究表明，糾正患者機體免疫缺陷，激活特異性抗腫瘤免疫反應，或許可以達到抑制腫瘤細胞生長或消滅腫瘤細胞的治療目的，我們的研究更好地描述了下咽鱗癌的免疫缺陷情況及其與生存期的相關性，將有助于未來更加合理地設計下咽鱗癌的免疫治療方法。

目前，盡管下咽鱗癌的化療、放療和重建手術(shù)等治療方式有了進步，但總體預后較差[1]。腫瘤免疫治療為這些患者提供了新的治療選擇和改善預后的希望[20]。Jin等[10]的研究指出，針對免疫細胞的5種紊亂類型，均有不同的免疫調(diào)節(jié)方案。我們的研究發(fā)現(xiàn)不同免疫狀態(tài)的下咽鱗癌患者其預后不同，后期我們將針對下咽鱗癌免疫細胞的5種紊亂類型，進行不同免疫調(diào)節(jié)方案的前瞻性研究，希望配合手術(shù)和放化療能改善下咽鱗癌的生存情況。

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