劉如月，范京惠，劉 濤, 苑軍輝，李清艷，翟向和*，左玉柱*

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/科教興農(nóng)中心，保定 071001； 2. 瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司，保定 071001； 3. 行唐縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所, 行唐 050600)

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)主要引起新生仔豬水樣腹瀉，致死率高達(dá)80%～100%[1]。自1973年，豬流行性腹瀉在我國(guó)多有發(fā)生[2]，2010年，在我國(guó)大規(guī)模暴發(fā)，給我國(guó)生豬產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的損失[3]。目前，市面上商品化的滅活疫苗和弱毒活疫苗不夠安全[4]。所以，研制一種安全且有效的新型PED疫苗就顯得尤為重要。

PEDV主要編碼E、S、M和N蛋白這4種結(jié)構(gòu)蛋白[5]。將PEDV的S蛋白分為S1、S2兩個(gè)區(qū)域，S1集中了多個(gè)中和表位，其中，包含兩個(gè)短的保守的B細(xì)胞中和表位，分別為744YSNIGVCK752和756SQYGQVKI771，它們主要決定病毒的抗原性[6-8]。所以，PED亞單位疫苗多基于S1蛋白來(lái)構(gòu)建。

乙肝核心抗原 (hepatitis B core antigen, HBcAg)能夠在酵母表達(dá)系統(tǒng)、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)及桿狀病毒-昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)等多種表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)[9]。本研究選擇的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和其他系統(tǒng)相比具有表達(dá)周期短、經(jīng)濟(jì)、易于操作和表達(dá)蛋白量高等優(yōu)點(diǎn)[10]。當(dāng)外源基因表位插入到HBcAg的主要免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)(MIR)時(shí)，可在原核系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，重組蛋白自發(fā)裝配成病毒樣顆粒(virus like particle, VLP)，且可增強(qiáng)外源基因表位的免疫原性[11-12]。VLP是具備病毒的一些抗原性，但不具備感染性的能夠自我組裝的類(lèi)病毒粒子。

因此，本研究以HBcAg作為呈現(xiàn)PEDV S1 抗原表位的載體，構(gòu)建了重組質(zhì)粒，表達(dá)獲得重組蛋白HBcAg-PEDV S1，通過(guò)透射電鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其可以形成VLP，這為今后研制PED的新型疫苗提供研究方法及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

限制性?xún)?nèi)切酶為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；PEDV HB/HS株(JQ862708.1) 及大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)菌細(xì)胞由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室保存；pcDNA3.1(+)-HBcAg(編碼1—144 aa)質(zhì)粒由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)王家鑫教授惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中乙肝核心抗原基因序列(KC774394)及PEDV的S基因(JQ862708.1，與CV777相似性為96.9%)，分別設(shè)計(jì)引物P1、P2及P5并添加相應(yīng)酶切位點(diǎn)及終止密碼子；設(shè)計(jì)引物P3-R重疊S1的18個(gè)堿基，設(shè)計(jì)引物P4-F重疊HBcAg的17個(gè)堿基(表1)。

表1 構(gòu)建重組質(zhì)粒的引物

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用引物P3、P4通過(guò)融合PCR擴(kuò)增HBcAg(編碼1—74 aa)-S1片段；用引物P5進(jìn)行PCR擴(kuò)增HBcAg(編碼83—144 aa)片段；回收目的片段進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化并且測(cè)序正確后，提取質(zhì)粒。對(duì)上述兩個(gè)質(zhì)粒用HindⅢ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切并連接。取連接完成的重組質(zhì)粒pET-32a(+)-HBcAg-PEDV S1，用EcoR Ⅰ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定,再送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.3 目的蛋白的表達(dá)及純化

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET-32a(+)-HBcAg- PEDV S1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，表達(dá)并純化重組蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)。

1.4 重組蛋白的復(fù)性

用尿素濃度梯度法透析法復(fù)性重組蛋白，檢測(cè)復(fù)性后的蛋白濃度，SDS-PAGE檢測(cè)。

1.5 透射電鏡檢測(cè)HBcAg-PEDV S1病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)

將復(fù)性蛋白濃度調(diào)整至200 μL·mL-1，取蛋白樣品滴于銅網(wǎng)上，滴加2%的磷鎢酸負(fù)染液，自然干燥后，將樣品置于透射電子顯微鏡下觀察樣品形態(tài)。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pET-32a(+)-HBcAg-PEDV S1的鑒定

用EcoRⅠ和XhoⅠ對(duì)pET-32a(+)-HBcAg- PEDV S1重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，可見(jiàn)702 bp的目的條帶，對(duì)重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果與目的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示,與預(yù)期完全相符，表明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。

2.2 重組蛋白HBcAg-PEDV S1的純化和復(fù)性

SDS-PAGE結(jié)果(圖1)顯示，重組蛋白HBcAg-PEDV S1通過(guò)純化和復(fù)性后,可見(jiàn)43.1 ku目的蛋白；復(fù)性蛋白濃度約為1.5 mg·mL-1。

M.蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET-32a(+)空載體對(duì)照；2.純化蛋白；3.復(fù)性蛋白

2.3 VLPs的透射電鏡鑒定

透射電鏡結(jié)果顯示，可看到大小均勻的粒子形成，并且直徑在30 nm左右，與預(yù)期相符(圖2)。

圖2 HBcAg-PEDV S1 VLP的透射電鏡觀察

3 討 論

目前,國(guó)內(nèi)控制PEDV的主要手段是為豬群接種傳統(tǒng)滅活疫苗和弱毒活疫苗。而傳統(tǒng)滅活疫苗多選用經(jīng)典毒株，這造成疫苗對(duì)各地的豬群免疫保護(hù)能力參差不齊；而弱毒活疫苗雖然免疫效果遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)滅活疫苗，但其研發(fā)成本較高、周期較長(zhǎng)，并且基于目前的研究和臨床觀察發(fā)現(xiàn)，有弱毒活疫苗與流行毒株基因重組的現(xiàn)象發(fā)生[13-14]，這就要求對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究，研發(fā)有效且安全的PED新型疫苗。

以HBcAg為載體可用于新型疫苗的研發(fā)，在美國(guó)等國(guó)家允許應(yīng)用于疫苗中[15]。近期在研發(fā)PED的亞單位疫苗中， 以基因重組HBcAg與PEDV S蛋白上的B細(xì)胞表位構(gòu)建了VLP，并且可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體，證明成功構(gòu)建PED的基因工程疫苗[16-17]。與其相比，本研究?jī)?yōu)勢(shì)在于利用融合PCR將其B細(xì)胞表位插入到HBcAg中，而不是直接由生物公司合成，降低成本的同時(shí)，可以達(dá)到相同的免疫效果。

VLP能夠自發(fā)裝配成類(lèi)病毒粒子，具備病毒的一些抗原性，但不具備感染性[18]。1986年，乙肝表面抗原(HBsAg)作為第一種基于病毒樣顆粒的商業(yè)疫苗被批準(zhǔn)上市[19]。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是第一個(gè)用于生產(chǎn)VLPs的系統(tǒng)，已經(jīng)生產(chǎn)了幾種商業(yè)VLPs疫苗，例如，抗戊型肝炎病毒VLPs疫苗[20]。

PEDV S1區(qū)包含多個(gè)主要B細(xì)胞表位和受體結(jié)合域，與病毒抗原性和吸附入侵密切相關(guān)。其主要的兩個(gè)B細(xì)胞表位為744YSNIGVCK752、756SQYGQVKI771[21]。 據(jù)此，本研究通過(guò)設(shè)計(jì)融合PCR[22]將PEDV S1 的B細(xì)胞表位插入到HBcAg中，成功構(gòu)建了pET-32a(+)-HBcAg-PEDV S1重組質(zhì)粒。將其誘導(dǎo)表達(dá)、純化并復(fù)性，通過(guò)透射電鏡檢測(cè)到形成VLPs，表明利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了PEDV S1 VLPs。本研究為后續(xù)PED疫苗的研制提供了進(jìn)一步的參考。

4 結(jié) 論

作者將PEDV S1中含B細(xì)胞表位的270 bp片段插入到HBcAg的MIR區(qū)域，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)其重組蛋白，經(jīng)過(guò)透射電鏡檢測(cè)到成功形成HBcAg-PEDV S1 VLPs，為今后PED疫苗的研究提供了進(jìn)一步的理論依據(jù)。