肖葉懿，郜重丞，包文斌,2，吳正常,2*，吳圣龍,2*

(1．揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009； 2. 教育部農業(yè)與農產品安全國際合作聯合實驗室，揚州 225009)

RNA修飾發(fā)生在轉錄后水平，包括100余種調控方式，其中RNA甲基化是RNA修飾的主要方式[1]。RNA甲基化與DNA甲基化類似，都是以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine, SAM)為甲基供體，在一系列酶的作用下，將甲基催化轉移到其他化合物的過程[2]。近年來，陸續(xù)發(fā)現一系列RNA甲基化修飾方式，6-甲基腺嘌(N6-methyladenosine，m6A)、5-甲基胞嘧啶(N5-methylcytosine，m5C)、1-甲基腺苷(N1-methyl-adenosine，m1A)是較為常見的類型[3]，其中對m6A的研究較為深入。腎母細胞瘤1-相關蛋白(Wilm’s tumor 1-associated protein，WTAP)是m6A甲基化轉移酶復合物的核心組分之一。現有大量研究表明，WTAP基因的表達紊亂能夠造成m6A甲基化調控失衡，與人類多種腫瘤通路的抑制和激活有關[4-8]；m6A甲基化修飾還與動物的生長發(fā)育以及疾病的發(fā)生和調控密切相關，然而在豬WTAP基因功能的報道較少。

斷奶仔豬腹瀉病(post-weaning diarrhoea, PWD)是造成仔豬死亡的主要原因之一，其中，F18大腸桿菌(E.coliF18)是引起仔豬細菌性腹瀉的主要病原菌之一。目前，已有相關研究從DNA甲基化修飾水平闡述了仔豬細菌性腹瀉的調控機制[9-10]，而在m6A RNA甲基化水平上尚無相關報道。本研究在個體水平上利用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測WTAP在斷奶蘇太仔豬E.coli抗性型與敏感型個體腸道組織的差異表達情況，并且在細胞水平上利用大腸桿菌F18ab、F18ac刺激和內毒素LPS誘導豬小腸上皮細胞系IPEC-J2，檢測處理前后WTAP基因mRNA表達水平的變化。同時，為了進一步探究WTAP基因表達水平與F18大腸桿菌感染的關系，本研究構建并獲得了RNA干擾WTAP基因的豬小腸上皮細胞系，并通過大腸桿菌菌毛定量和菌落計數試驗以及間接免疫熒光檢測沉默WTAP基因對豬小腸上皮細胞大腸桿菌(F18ab、F18ac)黏附能力的影響。本研究初步驗證了RNA甲基化酶WTAP與仔豬抗F18大腸桿菌感染的關系，為今后深入探討仔豬大腸桿菌抗性的RNA甲基化調控機制提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 材料

課題組前期進行F18菌株口服攻毒試驗，并通過糞便表型觀察、腸道E.coliF18菌落計數、組織病理檢測以及體外細菌黏附試驗，將出現“水樣糞便”、小腸上皮細胞大量黏附大腸桿菌的仔豬定義為敏感型個體，“正常糞便”、小腸上皮細胞幾乎不黏附大腸桿菌的仔豬定義為抗性型個體，建立了蘇太豬(Susscrofa)F18大腸桿菌抗性型與敏感型群體，并且已經基于抗性型與敏感型全同胞個體開展了大量相關工作[11-12]，本研究選擇F18大腸桿菌抗性型與敏感型斷奶仔豬公豬各4頭，屠宰后采十二指腸組織和空腸組織置于無酶管中，-70 ℃保存?zhèn)溆?。豬小腸上皮細胞系IPEC-J2由美國賓夕法尼亞大學惠贈；產腸毒素大腸桿菌F18ab、F18ac由揚州大學獸醫(yī)學院饋贈。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、LB培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；血液/組織/細胞DNA提取試劑盒購自天根生物科技有限公司(中國，北京)；LPS購自美國Sigma公司；干粉PBS緩沖液購自塞因坦科技有限公司(北京)；Trizol購自Invitrogen公司(美國)；反轉錄試劑盒SYBR、定量試劑盒購自Vazyme公司(中國，南京)；E.coli抗體購自美國GeneTeX公司；Anti-rabbit lgG二抗購自美國R&D Systems公司。

1.2 細胞總RNA的提取和RT-qPCR

1.2.1 細胞總RNA的提取及反轉錄 按照Trizol法分別提取每孔細胞中RNA，通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測RNA的濃度和純度，-70 ℃保存?zhèn)溆?。以每個個體RNA為模板進行反轉錄。反轉錄體系：細胞總RNA 500 ng，5×qRT SuPerMix Ⅱ 2 μL，無酶水補足至10 μL。反應程序：25 ℃ 10 min，50 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 保存。

1.2.2 熒光定量 PCR 根據NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫中豬WTAP基因的序列(序列號： NM_001244241.1)，同時以大腸桿菌菌毛蛋白基因PILIN(M25302.1)為模板設計定量引物，利用Primer Express 2.0軟件跨外顯子設計Real-Time PCR引物，并以GAPDH作為內參。上述引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物信息如表1所示。

表1 熒光定量引物序列

反應體系包含模板cDNA 2 μL，上、下游引物(10 μmol ·L-1)各0.4 μL，2 × AceQ qPCR SYBR Green 10 μL，50 × ROX Reference Dye I 0.4 μL，無酶水補足至20 μL，每個樣本設置3個重復。反應程序: 95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。擴增結束后，通過熔解曲線和擴增曲線分析產物特異性，程序：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。

1.3 大腸桿菌侵染和LPS誘導IPEC-J2細胞

取IPEC-J2細胞以1×106個·孔-1的密度接種到12孔板中，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，至密度達到接近80%；在LB培養(yǎng)基中分別接種E.coliF18ab、F18ac菌株，37 ℃ 200 r·min-1搖菌12 h，然后3 000 r·min-1離心10 min，收集菌體沉淀，PBS緩沖液重懸反復洗滌3次；稀釋菌體沉淀，加入細胞培養(yǎng)液后稀釋至細菌密度在1.0×109CFU·mL-1左右；12孔板中，按1 mL·孔-1加入菌液，每組菌體刺激設立3個重復孔，并設置1個未經菌體刺激空白孔作為對照，5 ℃ 恒溫培養(yǎng)4 h后，提取細胞RNA。

用細胞培養(yǎng)液將LPS稀釋至0.1 μg·mL-1，在12孔板中每孔加入1 mL細胞進行誘導，將只加細胞培養(yǎng)液的孔作為對照組，每組設置3個平行樣。分別在誘導后的2、4和6 h收集細胞。

1.4 構建靶向WTAP基因的siRNA干擾載體

針對WTAPmRNA設計3對siRNA序列和1個陰性對照序列(表2)，由上海吉瑪基因公司負責合成。使用Lipofectamine 2000將上述siRNAs和空白組(Mock)轉染至IPEC-J2細胞中，每個處理組設3個重復。轉染后在5% CO2的37 ℃ 細胞培養(yǎng)箱中過夜孵育，24 h后觀察熒光素標記(FAM)在IPEC-J2中的表達情況，通過RT-qPCR檢測并計算RNA干擾效率，選擇干擾效率較高的一組序列用于后續(xù)試驗。

表2 siRNA干擾序列

1.5 菌毛蛋白基因定量法檢測大腸桿菌對細胞的黏附情況

F18ab和F18ac菌株分別接種至LB液體培養(yǎng)液，37 ℃搖床220 r·min-1培養(yǎng)12 h，4 000 r·min-1離心5 min收集菌體沉淀，用PBS重懸沉淀并離心，重復洗滌3次。用細胞培養(yǎng)液將菌體沉淀稀釋到1.0×109CFU·mL-1。設大腸桿菌侵染組及空白組，分別按5.0×105個·孔-1將細胞鋪板到12孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)至90%左右的細胞覆蓋度。加入1.0 mL上述細菌稀釋液于細胞培養(yǎng)孔中，設置3個重復，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱孵育2 h。吸去孔中細菌培養(yǎng)液，PBS緩沖液重懸洗滌3次。

向培養(yǎng)孔中加入200 μL的DNA提取裂解液，按照DNA提取試劑盒試驗步驟提取細胞和細菌總DNA。以抽提所得混合DNA為擴增模板，通過熒光定量PCR檢測進行相對定量分析，每個樣本設置3個重復，引物信息見表1。

1.6 細菌計數法檢測大腸桿菌對細胞的黏附情況

大腸桿菌制備及細胞培養(yǎng)同上， PBS緩沖液重懸洗滌3次。立即用0.5% Triton X-100 (超純水配制)溶液處理細胞 20 min，再用移液槍吹打收集細菌懸液，將其按10倍梯度稀釋后涂布于LB固體平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)過夜。對1 000倍細菌稀釋液涂布的平板進行細菌計數，利用Image J軟件統計平板上的菌落數，最終用平板上的菌落數×103表示黏附細菌數(單位：CFU·mL-1)。

1.7 間接免疫熒光法觀察大腸桿菌對細胞的黏附情況

取出細胞生長密度達到90%左右的細胞爬片，PBS漂洗3遍，置于4%多聚甲醛4 ℃固定20 min，PBS沖洗5 min×3遍；1% Trtion X-100破膜處理15 min，PBS沖洗5 min×3遍；加入含5% BSA封閉液，37 ℃封閉1 h；加入抗E.coli一抗(濃度為1∶50， 使用含5% FBS的PBS配制)，37 ℃孵育2 h后，于4 ℃冰箱過夜；次日吸掉一抗，PBS沖洗5 min ×3遍；加入紅色熒光標記的二抗(濃度為1∶200，使用5% FBS的PBS配制)，37 ℃避光孵育1 h；吸掉抗體，PBST沖洗5 min×3遍；加入DAPI 溶液(1 mg·mL-1) 進行染核，37 ℃孵育5 min，PBST沖洗5 min×3遍；使用防熒光淬滅封片劑封片，于共聚焦顯微鏡下觀察。

1.8 數據處理與分析

采用2-△△Ct法對熒光定量結果進行處理，其中△△Ct=(待測目的基因平均Ct值-待測組內參基因平均Ct值)-(對照組目的基因平均Ct值-對照組內參基因平均Ct值)。利用SPSS 17.0軟件一般線性模型(general linear model，GLM)進行基因差異表達分析。

2 結 果

2.1 大腸桿菌抗性型和敏感型仔豬十二指腸和空腸組織中WTAP差異表達分析

對蘇太斷奶仔豬大腸桿菌抗性和敏感型個體十二指腸和空腸組織進行表達水平檢測。結果顯示(圖1)，在十二指腸和空腸組織中，抗性型個體WTAP基因mRNA表達量極顯著高于敏感型(P<0.01)。

*. P<0.05；**. P<0.01。下同

2.2 大腸桿菌感染豬小腸上皮細胞IPEC-J2后WTAP基因的表達水平

分別用F18ab、F18ac刺激小腸上皮細胞IPEC-J2，檢測WTAPmRNA的相對表達量。結果顯示(圖2),與對照組(Control)相比，F18ab和F18ac處理組WTAP基因mRNA表達量均顯著下降(P<0.01)。

Control表示空白對照。下同

2.3 LPS誘導豬小腸上皮細胞IPEC-J2后WTAP基因表達水平

由圖3可知，使用LPS誘導小腸上皮細胞后，WTAP基因表達量呈下降趨勢。與0 h相比，在誘導2和4 h后WTAP基因表達水平沒有顯著變化，但是在誘導6 h后其表達量極顯著下降(P<0.01)。

圖3 LPS誘導小腸上皮細胞IPEC-J2后不同時間WTAP的表達差異

2.4 RNAi干擾效率分析

干擾載體成功轉染細胞后，檢測WTAP基因mRNA的表達量，結果顯示siRNA-1相對表達水平為0.46，干擾效率為54%，干擾效率最高，可用于后續(xù)試驗(圖4)。

圖4 WTAP基因mRNA表達量及干擾效率分析

2.5 WTAP基因沉默對大腸桿菌黏附能力的影響

通過檢測大腸桿菌菌毛蛋白基因PILIN的表達水平以及對大腸桿菌的菌落計數來探究WTAP基因沉默對大腸桿菌黏附的影響，如圖5、6所示，WTAP基因沉默后，F18大腸桿菌(F18ab、F18ac)對豬小腸上皮細胞的黏附能力均極顯著上升(P<0.01)，其中，F18ab的黏附量高于F18ac。間接免疫熒光結果顯示，WTAP基因沉默后，IPEC-J2對F18大腸桿菌黏附量明顯增多(圖7)。

圖5 WTAP基因沉默的IPEC-J2細胞與F18大腸桿菌黏附水平的關系

圖6 WTAP基因沉默的IPEC-J2細胞對F18大腸桿菌黏附水平的菌落計數

藍色熒光代表DAPI染色的細胞核；紅色熒光代表結合大腸桿菌抗體的大腸桿菌

3 討 論

RNA作為中心法則的重要一環(huán)，對基因表達起著十分重要的作用，在幾種RNA甲基化修飾中，m6A修飾被認為是轉錄組中最普遍、豐富、保守的內轉錄修飾[13]。F18大腸桿菌是造成斷奶前后仔豬腹瀉的主要致病菌，F18大腸桿菌通過菌毛黏附在小腸內壁上，分泌內毒素(LPS)造成機體腸道的炎癥，打破小腸水鹽平衡，大量液體涌入腸腔引起腹瀉，雖然LPS是大腸桿菌造成細胞損傷的主要途徑，但并不代表大腸桿菌只能通過LPS破壞細胞結構，其黏附素、菌毛等仍會對細胞造成損傷[14-16]。因此，為了探究m6A甲基轉移酶WTAP是否與仔豬抗大腸桿菌感染有關，本研究在個體水平對m6A甲基轉移酶WTAP在斷奶仔豬大腸桿菌抗性型和敏感性型個體之間進行表達差異分析，同時在細胞水平用F18大腸桿菌(F18ab、F18ac)刺激和LPS誘導豬小腸上皮細胞IPEC-J2，結果發(fā)現，WTAP基因的高表達可能有助于仔豬抵抗大腸桿菌的侵染。為了進一步探究WTAP的表達水平與F18大腸桿菌感染的關系，本研究檢測WTAP基因沉默后，大腸桿菌對豬小腸上皮細胞黏附能力的影響。結果顯示，WTAP基因沉默后，大腸桿菌的黏附量明顯上升，表明WTAP基因的高表達有利于仔豬抵抗F18大腸桿菌的感染，其中大腸桿菌F18ab的黏附量高于F18ac。大腸桿菌F18ab與仔豬水腫病有關，F18ac與仔豬腹瀉相關，沉默WTAP基因后大腸桿菌F18ab的黏附量高于F18ac，說明WTAP可能在F18ab引起的仔豬水腫病中發(fā)揮重要作用。現有研究表明，WTAP本身并不具有甲基化活性，而是作為調節(jié)亞基在m6A修飾的形成過程中發(fā)揮定位作用，敲低WTAP表達量能夠顯著減少m6A修飾[17-18]，證明WTAP的表達水平與m6A修飾的形成密切相關。本研究中，大腸桿菌抗性型豬中WTAP基因表達量顯著高于敏感型，并且大腸桿菌刺激下調了該基因的表達，表明高m6A修飾可能有助于抵抗大腸桿菌F18的侵染，但是其具體機制仍有待研究。另一方面，在急性髓細胞性白血病、結直腸癌、腎細胞癌中[19-20]，WTAP過表達能夠促進細胞增殖，這可能是由于WTAP能夠影響某些細胞周期蛋白的mRNA穩(wěn)定性，進而影響細胞增殖周期[21]。同時，有研究表明，WTAP通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進結直腸癌細胞的增殖和遷移[22]，說明WTAP對細胞周期的影響是包括轉錄后修飾、通路調控等一系列綜合調控的結果。大腸桿菌通過分泌腸毒素造成小腸上皮細胞凋亡，而WTAP基因的高表達能夠促進細胞增殖分化，因此該基因的表達或許能夠加快豬小腸上皮細胞更新，進而維持腸道屏障的完整以抵抗大腸桿菌的侵染。

本研究發(fā)現并驗證了RNA甲基化酶WTAP的高表達有利于提高仔豬大腸桿菌抗性，但是其具體機制有待研究。因此，下一步將在蛋白水平上進一步驗證WTAP基因與大腸桿菌感染的關系，以及通過轉錄組測序技術篩選與WTAP調控仔豬抵抗大腸桿菌有關的相關通路，以期進一步探究RNA甲基化在仔豬抵御大腸桿菌侵染過程中的調控機制。

4 結 論

在十二指腸和空腸組織中，WTAP基因在抗性型個體中的表達量顯著高于敏感型個體(P<0.01)；并且在F18ab和F18ac刺激后表達量顯著下降；沉默WTAP基因后，大腸桿菌黏附能力極顯著上升(P<0.01)，在細胞和個體水平上初步發(fā)現并驗證了RNA甲基化酶WTAP的高表達有利于提高仔豬大腸桿菌抗性。