沈家鯤，唐 倩，崔洋洋，金曉明，李延森，李春梅

(南京農業(yè)大學動物科技學院 家畜環(huán)境控制與智慧生產研究中心，南京 210095)

豬舍空氣顆粒物是豬呼吸道疾病發(fā)生的重要原因之一，也是疾病傳播的重要媒介[1]。高密度、集約化的養(yǎng)豬生產導致豬舍空氣污染物濃度增加，造成豬群呼吸道疾病多發(fā)，嚴重影響?zhàn)B豬生產。其中，細顆粒物(fine particulate matter，PM2.5)因粒徑小，表面積大，易吸附攜帶更多有害物質，且可直接進入肺泡，危害最大[2]。研究表明，高濃度豬舍PM2.5會導致小鼠體重下降，肺組織出現(xiàn)病理損傷和炎癥[3]。肺泡巨噬細胞是肺內游離的免疫細胞，主要分布于肺泡表面，是肺抵御外源物質入侵的第一道防線，對維持肺部健康穩(wěn)態(tài)具有重要作用[4]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，豬舍PM2.5能夠誘導豬肺泡巨噬細胞(porcine alveolar macrophages，PAMs)發(fā)生炎癥反應，激活NLRP3炎性小體，引發(fā)細胞凋亡[5]。研究結果提示，豬舍PM2.5可誘發(fā)豬肺部炎癥損傷。

巨噬細胞具有高度的可塑性，能夠根據不同的微環(huán)境而改變自身表型[6]。根據激活方式的不同，可將巨噬細胞分為M1和M2型。M1型巨噬細胞可由脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)或腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)激活，這類巨噬細胞可分泌較高水平的促炎因子，如TNF-α、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)等[7]。同時，也可產生單核細胞趨化因子-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)等趨化因子，并通過趨化性吸引Th1細胞，促進強烈的Th1免疫反應。此外，M1型巨噬細胞還高表達誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)，并產生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)和一氧化氮(nitric oxide，NO)[8]。M2型巨噬細胞可由白介素-4(interleukin-4，IL-4)、白介素-10(interleukin-10，IL-10)、白介素-13(interleukin-13，IL-13)、糖皮質類激素等誘導產生，主要發(fā)揮抗炎作用，具有促進損傷修復和組織再生的功能。M2型巨噬細胞可分泌高水平的抗炎因子，如IL-10、IL-4、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)；低表達促炎因子，包括IL-12、IL-1β、 TNF-α等，同時也可增強精氨酸酶活性，緩解炎癥反應[9]。生物體內的巨噬細胞，在功能和活性上都介于M1型和M2型之間[10]。在具體的微環(huán)境中，巨噬細胞會根據微環(huán)境的變化不斷進行著表型間的轉換，維持一種動態(tài)平衡狀態(tài)，任何影響巨噬細胞M1/M2極化穩(wěn)態(tài)的因素都可能導致機體發(fā)生炎癥或疾病[11]。

PAMs是研究豬肺部炎癥與免疫的重要細胞模型，是豬肺炎支原體、豬繁殖與呼吸綜合征病毒等病原微生物感染的重要靶細胞[12-13]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，豬舍PM2.5誘導PAMs發(fā)生炎癥反應[5]，但PM2.5是否影響PAMs的極化尚不清楚。因此，本研究旨在通過建立原代PAMs模型，研究豬舍PM2.5對原代PAMs的細胞活力、NO分泌量、精氨酸酶活性，以及炎癥因子和極化表型標志物的mRNA表達水平的影響，探究PM2.5對原代PAMs極化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

原代PAMs分離自140日齡杜×大×長三元雜交豬；特氟龍濾膜購自Whatman公司；基礎培養(yǎng)基RPMI 1640和胎牛血清購自BI公司；青霉素-鏈霉素-兩性霉素B三抗購自Sigma公司；紅細胞裂解液、DAPI和Alexa Fluor488標記的山羊抗小鼠IgG二抗購自碧云天公司；小鼠F4/80抗體購自Servicebio公司；0.01 mol·L-1PBS、牛血清白蛋白(BSA)和Triton X-100購自北京索萊寶有限公司；多聚甲醛固定液購自Biosharp公司；細胞活力試劑盒、Diff-quik試劑盒和一氧化氮試劑盒均購自南京建成生物技術有限公司；Tris-HCl、硫酸和磷酸購自國藥試劑公司；氯化錳、尿素和L-精氨酸購自源葉公司；α-異亞硝基苯丙酮購自安耐吉化學公司；總RNA提取試劑盒和反轉錄試劑盒(HiScript Ⅱ Q RT SuperMix)購自諾唯贊公司；熒光定量試劑盒(2×T5 Fast qPCR Mix SYBR Green I)購自擎科公司。

1.2 PAMs分離與培養(yǎng)

豬屠宰放血后，用消毒過的棉線結扎主氣管(防止血液進入氣管)，分離豬肺。用預冷的PBS清洗肺表面后，開放主氣管，用含0.5%三抗的PBS灌洗豬肺。每次灌洗50 mL，停留2 min，回收肺泡灌洗液，反復3～4次，回收后的灌洗液4 ℃保存，并在24 h內完成PAMs提取。將4 ℃保存的肺泡灌洗液，于100目無菌不銹鋼篩過濾，過濾后的液體分裝，2 000 r·min-1離心10 min，棄上清，保留沉淀，加入紅細胞裂解液1～2 mL，37 ℃裂解紅細胞5 min。 裂解完成后2 000 r·min-1離心10 min，留沉淀，用1～2 mL無血清的RPMI 1640重懸，計數。按每孔1×106個細胞接種于6孔板，每孔3×105個細胞接種于24孔板，每孔1×105個細胞接種于96孔板，接種完成后，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，貼壁的細胞即為PAMs，換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 PM2.5的采集與提取

PM2.5的采集方法詳見先前的研究[5]，將采樣器置于集約化豬舍中，采樣器流量為16.67 L·min-1，PM2.5樣本被采集在直徑為47 mm的特氟龍濾膜上。每天采集PM2.5樣本23 h，從早上7:00至第二天早上6:00，采集樣本于-20 ℃保存。采集后的濾膜加入超純水，經超聲波振蕩后，用6層無菌紗布過濾，過濾后懸濁液于12 000 r·min-1離心40 min，保留沉淀。經冷凍干燥后，在干燥器內室溫平衡6 h后，加入一定量的生理鹽水，配制成1 mg·mL-1的母液，并高壓滅菌后于4 ℃保存，用以處理細胞。

1.4 試驗設計與處理

試驗分為對照組和PM2.5組(50 μg·mL-1)，PM2.5濃度的選擇參照課題組先前的研究[5]。純化后的細胞先培養(yǎng)24 h，PM2.5組細胞用含5%PM2.5母液的完全培養(yǎng)基(PM2.5終濃度為50 μg·mL-1)再培養(yǎng)4、8和12 h，對照組細胞用含有5%生理鹽水的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)4、8和12 h，兩組每個時間均設置3個重復，處理結束后收集相應的細胞上清和細胞用于指標檢測。

1.5 細胞形態(tài)觀察和活力測定

細胞純化后，先培養(yǎng)24 h，之后每24 h用倒置相差顯微鏡觀察記錄細胞形態(tài)變化和生長狀態(tài)，并測定細胞活力。96孔板內的細胞添加不同處理后，培養(yǎng)不同時間，到達設定的時間后，按MTT試劑盒說明書方法測定細胞活力。

1.6 PAMs的鑒定

1.6.1 Diff-quik染色 純化前的肺泡灌洗液采用涂片法制作涂片，室溫風干。接種PAMs于6孔 培養(yǎng)板細胞爬片上，純化后，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，室溫風干。參考黃燕霞等[14]方法，按照Diff-quik試劑盒進行染色。主要步驟：風干后的爬片于Reagent 1內固定10 s，Reagent 2內染色10 s，甩去多余液體，放入Reagent 3中染色10 s， 取出爬片，放入清水中洗去多余的染液，無水乙醇脫水2次，每次10 s，待干后，放入二甲苯中透明10 s，中性樹脂封片，鏡檢。

1.6.2 F4/80免疫熒光標記 F4/80為巨噬細胞膜表面蛋白，是巨噬細胞標志之一[15]。接種PAMs于6孔培養(yǎng)板細胞爬片上，純化后，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，加入4%多聚甲醛固定30 min，接著PBS洗滌3次，每個爬片加入100 μL的0.5% TritonX-100通透10 min后，PBS洗滌3次。每孔加入1 mL含1% BSA的PBS，室溫封閉1 h，棄去封閉液。用含1% BSA的PBS按1∶100稀釋一抗(小鼠F4/80單抗)，每個爬片上加入100 μL的一抗，37 ℃孵育1 h，棄去一抗，PBS洗滌3次。再用含1% BSA的PBS按1∶200稀釋二抗(Alexa Fluor 488標記的山羊抗小鼠IgG)，37 ℃避光孵育10 min。 每孔加入50 μL的DAPI，室溫避光孵育10 min， 棄去DAPI，PBS洗滌3次。在干凈的載玻片上滴加5 μL的抗淬滅劑，將爬片取出倒扣在載玻片上，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.7 巨噬細胞NO含量的測定

細胞處理后收集PAMs的細胞上清，2 500 r·min-1離心10 min，收集上清，按照NO試劑盒說明書方法測定NO含量，550 nm測定吸光度，計算細胞上清中的NO含量。

1.8 細胞內精氨酸酶活性的測定

參考Corraliza等[16]的方法，將處理后的細胞先用PBS洗滌2次，加入100 μL 0.1%Triton X-100，室溫裂解30 min，再加入100 μL 的50 mmol·L-1Tris-HCl和10 mmol·L-1MnCl2，56 ℃溫育10 min。加入100 μL 的0.5 mol·L-1精氨酸(pH 9.7)，37 ℃ 水解精氨酸60 min。加入900 μL H2SO4(96%)/H3PO4(85%)/H2O(1/3/7)終止反應。加入40 μL的9% α-異亞硝基苯乙酮(溶于100%乙醇)，95 ℃避光，溫育30 min。以尿素為標品建立標準曲線，在540 nm下測定吸光度，計算樣品的尿素濃度。每分鐘催化產生1 μmol尿素為酶的一個活性單位IU。

1.9 炎癥因子與極化表型相關基因的RT-PCR分析

用PBS洗滌6孔板里的細胞2次，利用總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，用Nanodrop?2000測定RNA濃度和純度，并使用HiScript II Q RT SuperMix將RNA反轉錄為cDNA，-20 ℃保存。按照2× T5 Fast qPCR Mix SYBR Green I試劑盒說明書操作反應進行。反應體系：T5 Fast qPCR Mix(2×)10 μL， 上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 4 μL，總體積為20 μL。使用QuantStudio?5 Real-Time PCR進行實時熒光定量反應檢測，設置反應條件：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性10 s，60 ℃ 退火延伸15 s，共40個循環(huán)；熔解曲線95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 1 s。每個RT-PCR均進行3個重復。使用2-△△Ct法以β-actin為內參基因測定相對mRNA表達水平。表1為細胞因子和極化標志物相關基因的引物序列。

表1 RT-PCR引物信息

1.10 數據統(tǒng)計與分析

試驗結果用“平均值±標準誤(SEM)”表示。采用Graphpad Prism 8.0(CA，USA)對數據進行分析，采用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析(ANOVA)中的Tukey多重比較法對數據進行比較分析，P<0.05則認為這些差異顯著，P<0.01則認為差異極顯著。

2 結 果

2.1 PAMs的形態(tài)觀察與活力測定

如圖1A所示，分離得到的PAMs呈圓形，大小不等。純化后，大部分細胞完全貼壁生長，在培養(yǎng)24～48 h內，細胞無明顯死亡現(xiàn)象，細胞逐漸發(fā)生變形，呈現(xiàn)為圓形、橢圓形或梭形等形狀。培養(yǎng)72 h后，一部分細胞出現(xiàn)死亡脫落。PAMs的細胞活力隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸降低(P<0.05，圖1B)，適宜的細胞處理時間應在純化后培養(yǎng)48 h內。

A. PAMs的形態(tài)學觀察，標尺=100 μm。B. PAMs的活力測定，n=3。柱形圖頂部不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 PAMs的鑒定

如圖2A所示，純化前的豬肺泡灌洗液中含有多種細胞成分，除PAMs外，還有大量紅細胞和細胞碎片。純化后的細胞可以清晰看出，PAMs呈紫色，大小不均一，呈圓形或橢圓形等形狀，細胞核較大，多偏向一側，細胞中偶爾可見2個細胞核，細胞質呈微嗜堿性，染成淺藍色。免疫熒光結果顯示(圖2B)， 分離純化后細胞帶有F4/80標記的均為PAMs。

A. Diff-quik染色。B. F4/80鑒定，F(xiàn)4/80-：未孵育F4/80抗體，F(xiàn)4/80+：孵育F4/80抗體

2.3 豬舍PM2.5對PAMs活力的影響

細胞活力測定結果顯示(圖3)，與對照組相比，PM2.5處理4、8 和12 h，PAMs的活力均沒有顯著變化(P>0.05)，表明PM2.5的短時間處理對PAMs的活力無明顯影響。

柱形圖頂部未標注者表示與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，下同，n=3

2.4 豬舍PM2.5對PAMs精氨酸代謝關鍵酶活性的影響

用PM2.5處理細胞4、8和12 h，PAMs分泌的NO量隨時間增加而增多，在4和12 h，PM2.5處理組PAMs分泌的NO量顯著高于對照組(P<0.05，圖4A)。PAMs的精氨酸酶活性隨時間增加而降低，與對照組相比，PM2.5處理4、8和12 h均極顯著降低PAMs精氨酸酶的活性(P<0.01，圖4B)。

A. NO測定。B. 精氨酸酶活性測定。*.P<0.05和**.P<0.01表示PM2.5組與對照組相比差異顯著，下同，n=3

2.5 豬舍PM2.5對PAMs炎癥因子表達水平的影響

如結果所示，與對照組相比，PM2.5處理不同時間均可提高PAMsIL-1β(圖5A)和TNF-α(圖5B)的mRNA表達水平，且呈時間依賴性增加，并在8和12 h差異顯著(P<0.01)。此外，與對照組相比，PM2.5處理8 h，顯著降低PAMs抗炎因子IL-10 mRNA表達水平(P<0.05，圖5C)。

A. RT-PCR檢測PM2.5處理后不同時間IL-1β的相對表達量。B. RT-PCR檢測PM2.5處理后不同時間TNF-α的相對表達量。C. RT-PCR檢測PM2.5處理后不同時間IL-10的相對表達量，n=3

2.6 豬舍PM2.5對PAMs的M1及M2型巨噬細胞標志物表達的影響

與對照組相比，PM2.5處理4 h時，M1型巨噬細胞標志物CD80 mRNA表達水平顯著提高(P<0.01，圖6A)。另外，與對照組相比，PM2.5處理8 h顯著降低M2型巨噬細胞標志物CD206 mRNA表達水平(P<0.01，圖6B)。

A. RT-PCR檢測PM2.5處理后不同時間CD80的相對表達量。B. RT-PCR檢測PM2.5處理后不同時間CD206的相對表達量，n=3

3 討 論

肺泡灌洗液中的主要成分是巨噬細胞，一般占肺泡灌洗液細胞的90%以上[17]。目前，通過肺泡灌洗液提取原代肺泡巨噬細胞的方法已得到廣泛應用。綜合前人研究發(fā)現(xiàn)，利用不同細胞在無血清培養(yǎng)基中的貼壁時間不同這一特點[18-20]，通過差速離心貼壁法可以分離純化獲得PAMs。本試驗也采用差速離心貼壁法從豬肺泡灌洗液中分離純化獲得PAMs，并通過觀察細胞形態(tài)和Diff-quik染色及F4/80免疫熒光標記的方法對PAMs進行鑒定，證實這一方法的有效性。從肺泡灌洗液中分離提取細胞時，一定要注意避免血液污染，一旦有大量的血液混入肺泡灌洗液，容易導致紅細胞裂解不完全，并易造成污染。另外，肺泡灌洗液中可添加0.5%的三抗(青霉素-鏈霉素-兩性霉素B)，這樣可以有效避免分離提取操作時的二次污染。本研究結合已有的研究，進一步完善了原代PAMs的分離提取方法。本試驗結果表明，分離提取的PAMs在培養(yǎng)過程中沒有出現(xiàn)明顯的增殖現(xiàn)象，在培養(yǎng)72 h后細胞數量可以看到明顯的減少，這也是原代巨噬細胞培養(yǎng)一直令人困擾的問題。有研究報道，巨噬細胞屬于終末分化細胞，不會增殖[20]，但在特殊條件下，巨噬細胞也可能會發(fā)生增殖[21]。因此，在細胞活力較為穩(wěn)定的時間點對細胞進行試驗處理，可以有效避免因原代細胞脫落死亡而造成的對試驗結果的影響。

豬舍PM2.5表面含有大量的LPS和金屬離子等，這些都是誘發(fā)巨噬細胞發(fā)生炎癥反應的重要因素[22-23]。當清除PM2.5中LPS后，PM2.5誘導的炎癥反應會減輕[24]。先前的研究證實，豬舍PM2.5可通過TLR4/MAPK/NK-κB信號通路激活PAMs，提高NLRP3炎性小體蛋白水平，誘發(fā)IL-1β、IL-18、TNF-α和COX-2表達提高[5]。在本研究中，原代PAMs在處理PM2.5后，同樣發(fā)現(xiàn)促炎因子的高表達，這與前期的研究結果一致。此外，本試驗發(fā)現(xiàn)，抗炎因子IL-10的表達水平在一定程度上受到抑制，這與M1型巨噬細胞中抗炎因子低表達相似[9, 25]。

精氨酸代謝的差異是M1型和M2型巨噬細胞的主要代謝差異。iNOS在M1型巨噬細胞內高表達，分解精氨酸為瓜氨酸和NO，在機體抵御細胞內病原體感染中起到重要作用，M2型巨噬細胞分泌的精氨酸酶Ⅰ (arginase Ⅰ，Arg-1)可以與iNOS競爭性地結合底物精氨酸，分解精氨酸為鳥氨酸和尿素[26]。正常情況下，iNOS與Arg-1的表達和活性在巨噬細胞中受到嚴格調控，兩者的動態(tài)平衡在維持巨噬細胞功能穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用[27]。PM2.5處理小鼠巨噬細胞，產生大量NO，同時，精氨酸酶活性降低[28]。本試驗中，在PM2.5處理下，PAMs產生的NO含量明顯增加，而精氨酸酶的活性顯著下降，這與前人研究結果相似。本研究表明，PM2.5處理改變了肺泡巨噬細胞精氨酸代謝關鍵酶的活性，促進肺泡巨噬細胞向M1型轉變。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，豬舍空氣PM2.5中的LPS含量高達(681.80±19.47) EU·mg-1，遠遠高于大氣PM2.5中的LPS含量[5]。另外，由于LPS已是公認的M1型巨噬細胞激活劑[29]，因此推測，PM2.5誘導的PAMs極化可能與PM2.5高含量的LPS有關。CD80是M1型巨噬細胞的標志物之一，CD206又稱甘露糖受體，是M2型巨噬細胞的標志物之一[30]。為進一步證實PM2.5引發(fā)PAMs的極化，本研究進一步檢測了M1和M2型巨噬細胞標志物的表達情況。研究發(fā)現(xiàn)，CD80 mRNA表達水平在PM2.5短期處理(4 h)時顯著上升，而CD206 mRNA表達水平在8 h處理時顯著下降。這些結果表明，PM2.5很可能誘導了巨噬細胞從M2向M1的轉化，破壞了巨噬細胞M1/M2的平衡，進而促進炎癥的發(fā)生。

巨噬細胞M1/M2的平衡對肺部健康至關重要。在通常情況下，當機體受到細菌感染，巨噬細胞會向M1極化，啟動急性感染期的炎癥反應，清除病原菌。炎癥反應后期，巨噬細胞向M2極化，釋放抗炎因子，促進組織修復。巨噬細胞極化的平衡在哮喘[31]和慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)[32]中具有重要的作用，通過調控巨噬細胞極化的方向，成為COPD等炎癥性肺部疾病治療的新策略[33]。有研究表明，高濃度的PM2.5暴露會進一步加重哮喘小鼠氣道炎癥[34]。此外，PM2.5濃度的升高也會加劇COPD引發(fā)的炎性反應，誘發(fā)疾病的發(fā)生[35-36]。本試驗發(fā)現(xiàn)，PM2.5處理破壞了PAMs的極化平衡，加劇炎癥反應。因此，PM2.5加劇呼吸道疾病可能與改變巨噬細胞極化有關。豬長期處于高濃度PM2.5環(huán)境，PAMs的極化失衡可能會增加豬呼吸道疾病發(fā)生率，進一步影響豬呼吸道疾病的轉歸。

4 結 論

綜上所述，豬舍來源的PM2.5在體外破壞了PAMs的M1/M2平衡，這種改變隨時間的延長而加深，并促進巨噬細胞分泌高水平的NO和炎癥因子，表明PM2.5在體外能夠促進巨噬細胞向M1極化，加劇炎癥反應。體外分離培養(yǎng)的原代PAMs能夠較好地模擬PM2.5對肺泡微環(huán)境的影響，為后續(xù)研究微生物和病原菌等對PAMs的影響提供借鑒。