劉君雯，吳瓊娟，邢 剛，占松鶴，魏建忠，孫 裴，劉雪蘭，李 郁*

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，合肥 230036； 2. 馬鞍山史記動物健康管理有限公司，馬鞍山 238251； 3. 安徽省動物疫病預防與控制中心，合肥 230091)

豬丹毒(swine erysipelas，SE)是由豬丹毒絲菌(Erysipelothrixrhusiopathiae，ER)引起豬的一種高度傳染性疾病，最易侵害母豬和架子豬，臨床表現(xiàn)主要有突然死亡的急性敗血型、皮膚紫色菱形疹塊的亞急性型、多發(fā)性關節(jié)炎或心內膜炎的慢性型等3類[1-3]，常引起重大的經(jīng)濟損失。20世紀80年代，SE與豬瘟、豬肺疫并稱為我國養(yǎng)豬業(yè)的3大傳染病。到了90年代，隨著疫苗的普遍使用及豬場管理的升級，SE病例顯著減少。但自2010年以后，國內多家實驗室研究結果顯示，SE在我國出現(xiàn)流行的趨勢[4-6]。

目前，在養(yǎng)豬生產(chǎn)中，使用抗生素和接種疫苗是防治SE的常用手段。隨著新型ER耐藥菌株的出現(xiàn)，疫苗免疫則成為控制SE最經(jīng)濟、最有效的選擇。然而滅活疫苗成本高，減毒活疫苗可能存在散毒風險，因此迫切需要研制出有效的亞單位疫苗或基因工程疫苗。ER最重要的毒力因子是神經(jīng)氨酸酶、莢膜多糖和表面蛋白，其中表面蛋白SpaA目前公認是ER的主要免疫抗原，為SE亞單位疫苗研究奠定了基礎[7-9]。ER表面的膽堿結合蛋白(choline-binding protein, CBPs)由CbpA、CbpB、CbpC三部分組成。CbpB基因大小為1 855 bp，編碼的CpbB蛋白由606個氨基酸組成，主要包括N端的一段信號序列(the signal sequence)和C端的膽堿結合區(qū)域(choline-binding domain)[10]。研究表明，CbpB作為ER莢膜修飾蛋白[11]，不僅介導增強ER對宿主細胞的黏附作用、減弱吞噬細胞對病原菌的吞噬作用，而且經(jīng)CbpB蛋白免疫的小鼠血清具有促進體外巨噬細胞的吞噬作用[12-13]。

本研究以表達的ER重組蛋白CbpB、SpaA、CbpB+SpaA以及ER滅活全菌體(V-AEr21)、商品化弱毒疫苗、商品化滅活疫苗分別免疫小鼠，利用間接ELISA檢測血清中IgG抗體，血清殺菌試驗測定功能性抗體水平，腹腔攻毒試驗測定免疫保護率，組織荷菌數(shù)測定ER定植情況，并制作肺、肝、脾、腎組織切片，觀察病理變化，綜合評價CbpB蛋白的免疫原性和免疫保護力，從而為研制SE亞單位疫苗或基因工程疫苗提供新的思路和技術儲備。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

ER-AEr 21(血清型1a型，源自急性敗血型，LD50為50.3 CFU·mL-1)、ER-AEr31(血清型1a型，源自急性敗血型，LD50為35.5 CFU·mL-1)、重組質粒pGEx-6P-1-SpaA、pGEx-6P-1-CbpB均由安徽農(nóng)業(yè)大學動物傳染病實驗室保存。

1.2 實驗動物

18～22 g 清潔級雌性昆明小鼠購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.3 主要試劑

HRP標記的山羊抗鼠IgG、IgA(IgG-HRP、IgA-HRP)購自博士德生物工程有限公司；弗氏完全佐劑、不完全佐劑購自美國SIGMA公司；商品化豬丹毒滅活疫苗購自四川海林格生物制藥有限公司(生產(chǎn)批號：20171001)；商品化豬丹毒弱毒疫苗(GC42株)購自廣西麗原生物股份有限公司(生產(chǎn)批號：18060601)。

1.4 SpaA蛋白、CbpB蛋白的表達、純化與鑒定

將重組質粒(pGEx-6P-1-SpaA和pGEx-6P-1-CbpB)菌分別接種到LB肉湯中并振蕩培養(yǎng)12 h。分別吸取1 mL菌液轉接于100 mL含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，并將其振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入0.6 mmol·L-1的IPTG在37 ℃誘導4 h。 離心收集菌體并進行超聲破碎后再次離心取上清，將蛋白液與GST瓊脂糖凝膠FF在冰盒上振蕩結合1.5 h，再用PBS緩沖液洗滌雜蛋白，最后用20 mmol·L-1谷胱甘肽進行洗脫。通過核酸蛋白儀測定純化后的目的蛋白含量[14-15]。將純化后的目的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，于含5%脫脂奶粉的封閉液中4 ℃封閉過夜。以ER陽性血清(1∶100稀釋)為一抗，37 ℃孵育1 h，洗膜后用1∶2 000 稀釋的羊抗豬IgG-HRP為酶標二抗，37 ℃孵育1 h，最后置于DAB緩沖液中顯色。

1.5 ER-AEr21滅活全菌體的制備

將ER-AEr 21在TSB-YE(含5%小牛血清)培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)生長至穩(wěn)定期后，用終濃度為0.2%的甲醛滅活11 h，離心收集菌體[16]，即成V-AEr21。

1.6 免疫及攻毒保護試驗

1.6.1 試驗分組 將280只小鼠隨機分成8組(編號A～H)，每組35只，其中A～F為試驗組，G、H組均為對照組。免疫試驗中G組為生理鹽水對照組，攻毒保護試驗中G組為攻毒對照組、H組為空白對照組。試驗分組及免疫方法見表1。采取二次免疫，第一次免疫14 d后采用同樣方式和同等劑量進行第二次免疫。

表1 試驗分組

1.6.2 免疫試驗

1.6.2.1 血清中IgG抗體檢測: 二免14 d后，每組取5只小鼠進行眼球靜脈叢采血，間接ELISA檢測血清中IgG抗體效價[17]。

1.6.2.2 血清殺菌試驗: 采集第一次免疫和第二次免疫14 d后的所有免疫組和陰性對照組的小鼠血清，每組5只。將陰性兔血清分為未滅活兔血清(不做任何處理)和滅活兔血清(56 ℃熱處理30 min) 備用。在96孔細胞板中倍比稀釋免疫組小鼠血清以備用。試驗組每孔含25 μL倍比稀釋的血清+未滅活兔血清12.5 μL+AEr31菌懸液12.5 μL(含AEr31 2.0×104CFU·mL-1)，同時設置補體對照(未滅活兔血清12.5 μL+菌懸液12.5 μL+稀釋液25 μL)和體系對照(滅活兔血清12.5 μL+菌懸液12.5 μL+稀釋液25 μL)，37 ℃孵育1 h后。后涂布于TSA-YE固體培養(yǎng)上，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后進行菌落計數(shù)。如試驗組孔內菌落數(shù)為補體對照孔的50%以下，則判斷為“殺菌”，否則判斷為“不殺菌”。重復試驗2次[18]。

1.6.3 攻毒保護試驗 二免14 d后，每組取10只 小鼠，采用腹腔注射方式對A～G組進行攻毒，攻毒菌株為 AEr31(劑量為100 LD50)，G組為攻毒對照組，H組注射等量滅菌生理鹽水作為空白對照組。攻毒后，觀察7 d，記錄各組小鼠的精神狀態(tài)及死亡等情況，并計算各組的免疫保護率。免疫保護率(%)=(1-免 疫組死亡率/對照組死亡率)×100%。

1.6.4 組織荷菌數(shù)測定與病理學觀察 攻毒3 d后，每組取5只小鼠，無菌采取小鼠的肺、肝、脾和腎于1.5 mL的離心管中，稱重并記錄，計算組織質量，研磨后按照10倍遞增稀釋，分別取100、10-1、10-23個稀釋度的組織懸液1 mL，將其均勻涂于TSA-YE固體培養(yǎng)基上；37 ℃培養(yǎng)18～24 h，平板計數(shù)法統(tǒng)計細菌菌落數(shù)。

攻毒14 d后，每組取3只小鼠，采集各組小鼠的內臟(肝、脾、肺、腎)，置于福爾馬林(濃度為10%的甲醛)中，24 h后重新更換福爾馬林，進行固定和保存。送至安徽醫(yī)科大學制作病理組織切片，觀察各臟器的病理組織學變化。

2 結 果

2.1 SpaA蛋白、CbpB蛋白的表達、純化與鑒定

重組質粒(pGEx-6P-1-SpaA和pGEx-6P-1-CbpB)菌經(jīng)過誘導表達并純化，SDS-PAGE電泳結果顯示：獲得了純度較高的GST-SpaA蛋白和GST-CbpB蛋白，兩種蛋白均以可溶性形式進行表達，純化后的重組蛋白GST-SpaA含量為0.65 mg·mL-1，GST-CbpB為0.58 mg·mL-1。對純化后的SpaA、CbpB重組蛋白進行Western blot分析，分別在75和73 ku處出現(xiàn)預期的特異性條帶，表明表達產(chǎn)物能夠與ER陽性血清發(fā)生特異性結合，具有良好的反應原性。詳見圖1、2。

A. 重組蛋白GST-SpaA純化分析；B. 重組蛋白SpaA的Western blot鑒定；M1.蛋白相對分子質量標準；M2.蛋白相對分子質量標準；1.純化后的SpaA蛋白；2.未純化的SpaA蛋白；3.純化后的SpaA蛋白；4.陰性對照

A. 重組蛋白GST-CbpB純化分析；B. 重組蛋白CbpB的Western blot鑒定；M1.蛋白相對分子質量標準；M2.蛋白相對分子質量標準；1.純化后的CbpB蛋白；2.未純化的CbpB蛋白；3.純化后的CbpB蛋白；4.陰性對照

2.2 AEr21滅活全菌體的制備

AEr21培養(yǎng)8～10 h達到穩(wěn)定期后，將其濃度調整至1.5×1010CFU·mL-1，滅活后即為V-AEr21。

2.3 免疫及攻毒保護試驗

2.3.1 血清中IgG抗體檢測結果 除了A、B組之外，其他試驗組在二免后抗體效價均升高。結果顯示，商品化弱毒疫苗產(chǎn)生的抗體效價最高，SpaA、CbpB產(chǎn)生的抗體效價最低且相同(圖3)。

縱坐標中，“1”代表免疫后IgG抗體效價為“1∶6 400”，“2”代表“1∶12 800”，“8”代表“1∶51 200”。橫坐標中，A. SpaA；B. CbpB；C. V-AEr21；D. CbpB+SpaA；E.商品化弱毒疫苗；F.商品化滅活疫苗；G.對照組

2.3.2 血清殺菌試驗結果 各試驗組在二免后對ER均具有一定的殺菌作用，其細菌數(shù)量位于G組50%以下并與G組均差異顯著(P<0.05)。E組細菌數(shù)量最少，為4.92×103CFU·mL-1，與其他試驗組差異顯著(P<0.05)；A、B組的細菌數(shù)量分別為5.76×103和5.92×103CFU·mL-1，D組的細菌數(shù)量為6.68×103CFU·mL-1，C、F組的細菌數(shù)量分別為7.56×103和7.48×103CFU·mL-1。A、B組與C、D、F組相比，細菌數(shù)量顯著減少(P<0.05)，而A、B組之間差異不顯著(P>0.05)；D組與C、F組相比，細菌數(shù)量差異顯著降低(P<0.05)(圖4)。結果顯示，商品化弱毒疫苗的殺菌效果最強，其次是SpaA、CbpB，再者為SpaA+CbpB。

A. SpaA；B. CbpB；C. V-AEr21；D. CbpB+SpaA；E.商品化弱毒疫苗；F.商品化滅活疫苗；G.對照組。 相同免疫后時間內不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)， 下同

2.3.3 免疫保護率測定結果 攻毒7 d后，G組所有小鼠全部死亡，H組所有小鼠全部存活，除C、F組之外的各試驗組均具有良好的免疫保護水平，保護率為100%(圖5)。結果顯示，SpaA、CbpB、SpaA+CbpB和商品化弱毒疫苗對小鼠的免疫保護率均為100%，而V-AEr21、商品化滅活疫苗免疫保護率分別為30%和20%。

2.3.4 組織荷菌數(shù)測定結果 攻毒3 d后，C、F組與G組相比各臟器(肝、脾、肺、腎)載菌量顯著降低(P<0.05)，而其他試驗組(A、B、D、E組)均無細菌定植(圖6)。結果顯示，SpaA、CbpB、SpaA+CbpB和商品化弱毒疫苗均能顯著降低ER在小鼠體內的定植量。

A. SpaA；B. CbpB；C. V-AEr21；D. CbpB+SpaA；E.商品化弱毒疫苗；F.商品化滅活疫苗；G.攻毒對照組

2.3.5 病理組織學觀察

2.3.5.1 肺：H組整體結構正常，肺泡結構清晰，肺泡壁無明顯增厚；G組組織可見肺動脈血管充血和明顯炎癥細胞浸潤。在各試驗組(A～F組)中，A、D組肺支氣管輕微出血；B組輕微炎癥細胞浸潤；C組可見明顯的炎性細胞浸潤；E組未見明顯病變；F組肺泡壁明顯增厚(圖7)。結果顯示，商品化弱毒疫苗的保護作用最強，其次是SpaA、CbpB、SpaA+CbpB。

A. SpaA；B. CbpB；C. V-AEr21；D. CbpB+SpaA；E.商品化弱毒疫苗；F.商品化滅活疫苗；G.攻毒對照組；H.空白對照組

2.3.5.2 肝：H組整體結構正常，肝組織中央靜脈輪廓清晰，肝細胞結構飽滿；G組肝細胞結構疏松，肝細胞廣泛水腫，部分水腫至空泡變性。在各試驗組(A～F組)中，A組肝竇間隙輕微增大；B、D組輕微炎癥細胞浸潤；C、F組明顯的炎癥細胞浸潤；E組肝細胞結構疏松(圖8)。結果顯示，SpaA、CbpB、SpaA+CbpB和商品化弱毒疫苗均具有較強的保護作用。

A. SpaA；B. CbpB；C. V-AEr21；D. CbpB+SpaA；E.商品化弱毒疫苗；F.商品化滅活疫苗；G.攻毒對照組；H.空白對照組

2.3.5.3 脾：H組整體結構正常，脾小結結構清晰，紅髓白髓界限分明；G組整體結構輕度異常，脾小體結構消失，紅髓白髓界限不清，組織可見大量粒細胞浸潤。在各試驗組(A～F組)中，A組結締組織增多；B、E組無明顯病變；C、D、F組少量粒細胞浸潤(圖9)。結果顯示，CbpB、商品化弱毒疫苗的保護作用最強。

A. SpaA；B. CbpB；C. V-AEr21；D. CbpB+SpaA；E.商品化弱毒疫苗；F.商品化滅活疫苗；G.攻毒對照組；H.空白對照組

2.3.5.4 腎：H組結構正常，腎小結結構清晰可見，組織未見明顯炎癥細胞浸潤；G組腎小管上皮細胞脫落水腫，部分腎小球萎縮，組織可見明顯的炎癥細胞浸潤。在各試驗組(A～F組)中，A組少量炎癥細胞浸潤；B組血管明顯充血；C組部分腎小球萎縮，組織可見少量炎癥細胞浸潤；D、E組未見明顯病變；F組組織間質明顯瘀血(圖10)。結果顯示，SpaA+CbpB、商品化弱毒疫苗的保護作用最強，其次是SpaA、CbpB。

A. SpaA；B. CbpB；C. V-AEr21；D. CbpB+SpaA；E.商品化弱毒疫苗；F.商品化滅活疫苗；G.攻毒對照組；H.空白對照組

3 討 論

抗原能否成為疫苗候選抗原的其中一個指標就是抗原刺激機體產(chǎn)生的免疫反應及其類型[14-15,19]。IgG在機體抗細菌感染的免疫中發(fā)揮著重要的作用。血清中產(chǎn)生的抗體能與細菌產(chǎn)生特異性的結合，從而對細菌造成一定的殺菌效果。本研究中，盡管商品化弱毒疫苗產(chǎn)生的抗體效價最高為1∶51 200，而CbpB、SpaA重組蛋白均僅為1∶6 400，其余各組則為1∶12 800～1∶25 600，但在血清殺菌試驗中，除了商品化弱毒疫苗外，CbpB和SpaA重組蛋白均呈現(xiàn)出較強的殺菌效果，表明CbpB重組蛋白刺激機體產(chǎn)生的功能性抗體能夠抵抗細菌的感染，具有良好的免疫作用。造成檢測抗體效價低的可能原因是：本研究中用于檢測抗體效價的ELISA采用的是全菌體超聲破碎裂解物作為包被抗原，與全菌體相比，單一蛋白作為免疫抗原刺激機體僅產(chǎn)生相對應的特異性抗體，因此抗體水平的檢測值會出現(xiàn)偏低的現(xiàn)象。而姚焱彬等[20]利用SpaA重組蛋白作為包被抗原建立的ELISA進行免疫小鼠的血清抗體檢測，結果顯示SpaA重組蛋白免疫產(chǎn)生的IgG水平顯著高于滅活全菌體，這也可進一步詮釋CbpB和SpaA重組蛋白產(chǎn)生的抗體效價不及其他組的原因。

ER主要是通過消化道或損傷皮膚的黏膜引起機體產(chǎn)生局部或全身性的感染[21]。病原菌在造成機體產(chǎn)生永久性的病理性損傷的同時，也引起了機體產(chǎn)生一系列的抵抗反應行為，炎癥的本質就是機體在應對病原菌入侵時引起損傷產(chǎn)生的一種防御性反應[22]。研究發(fā)現(xiàn)，結核分枝桿菌(MTB)在小鼠肺組織低荷菌數(shù)的狀態(tài)下，能夠持續(xù)刺激機體產(chǎn)生免疫應答引發(fā)輕度的病理損傷[23]。但當細菌侵入已產(chǎn)生特異性免疫應答的機體中，機體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫能夠將病原體殺滅，使病原體數(shù)量減少或滅亡，減輕對機體的病理損傷，從而對機體產(chǎn)生良好的保護力，產(chǎn)生耐受現(xiàn)象[22,24]。本研究中采用腹腔注射的方式對第二次免疫后的小鼠進行攻毒，結果顯示：除商品化滅活疫苗和V-AEr21對ER強毒株的攻毒保護率僅為30%和20%外，其余試驗組均為100%，且均無細菌定植；結合肺、肝、脾和腎的病理組織學觀察，CbpB重組蛋白同商品化弱毒疫苗、SpaA重組蛋白一樣均表現(xiàn)出無病變或病變輕微(肺、肝均輕微炎癥細胞浸潤)。表明CbpB重組蛋白產(chǎn)生良好的免疫應答能夠殺滅體內的ER，從而阻止機體產(chǎn)生系統(tǒng)性感染，具有較強的保護作用。

4 結 論

免疫小鼠試驗證明，CbpB重組蛋白誘導產(chǎn)生的高水平IgG抗體具有較強的殺菌效果；攻毒試驗及病理組織學觀察顯示，CbpB重組蛋白具有良好的免疫原性和保護作用，能刺激機體產(chǎn)生較強的體液免疫和細胞免疫，可以作為豬丹毒基因工程亞單位疫苗的候選抗原。