朱鎮(zhèn)宇，黃 翔，孫俊龍，施金龍

（1南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇226001；2南通大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科）

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)腦腫瘤[1]，占成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性惡性腫瘤的75%[2]。在世界衛(wèi)生組織（WHO）2016年更新版中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類中，膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma，GBM）屬于Ⅳ級膠質(zhì)瘤，惡性程度最高，預(yù)后不良。傳統(tǒng)手術(shù)及放療對GBM患者生存期改善的效果不佳，因此探索膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制對尋找新的診療方法具有重要意義。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）長度大于200個核苷酸[3-4]，越來越多的研究報道LncRNAs異常表達可能參與膠質(zhì)瘤的發(fā)病過程，包括細胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移[5-7]。LncRNAs異常表達可作為膠質(zhì)瘤早期診斷的生物標志物，并可作為治療靶點[8-9]。本研究通過高通量測序獲取GBM的lncRNAs表達譜，對差異表達的lncRNAs進行基因本體（GO）富集化分析和通路富集化分析，以期探索GBM新的診療方法。

1 材料與方法

1.1 患者與樣本招募 6例腦外傷患者和6例經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診的GBM患者，腦外傷患者中男性3例，女性3例，年齡35～64歲，GBM患者中男性3例，女性3例，年齡43～72歲。手術(shù)切取腦外傷患者正常腦組織和GBM患者腫瘤組織，于60 min內(nèi)轉(zhuǎn)移至-80℃保存。兩組患者均無其他嚴重疾病，GBM患者未接受過化療或放療。本實驗經(jīng)南通大學(xué)倫理委員會批準，所有患者簽署知情同意書。

1.2 RNA文庫構(gòu)建及RNA測序 使用Trizol試劑（Invitgen，Cat No.15596-026，USA）從腦組織樣本中提取總RNA，使用Ribo-Zero rRNA去除試劑盒（Illumina，USA）從總RNA樣品中去除rRNA，然后利用TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit（Illumina，USA）構(gòu)建RNA文庫。對文庫進行質(zhì)量控制，應(yīng)用BioAnalyzer 2100系統(tǒng)（Agilent Technologies，USA）進行量化。將10-pM文庫變性為單鏈DNA分子，在Illumina Flow細胞上捕獲，原位擴增成簇，擴增150個循環(huán)，并在Illumina HiSeq Sequencer上進行測序。用hisat 2軟件將生成的高質(zhì)量reads與人類參考基因組（UCSC hg19）比對。然后在EnSembl基因注釋文件的指導(dǎo)下，使用cuffdiff軟件以每百萬映射讀數(shù)轉(zhuǎn)錄本（FPKM）值為單位的片段來揭示lncRNAs的表達譜，隨后鑒定差異表達的lncRNA。

1.3 GO富集分析 將GBM中差異表達基因（DEGs）映射到GO數(shù)據(jù)庫（http://www.geneontolo gy），基于“GO::TermFinder”應(yīng)用超幾何分布檢驗，在DEGs輸入列表中查找顯著豐富的GO項（http://smd.stanford.edu/help/GO-TermFinder/GO_TermFinder_help.shtml），采用Bonferroni校正P值。以P≤0.05的錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）作為閾值，滿足此條件的GO項被定義為顯著富集。

1.4 通路富集分析 根據(jù)京都基因和基因組學(xué)百科全書（KEGG），通路富集分析用來確定與通路相關(guān)的DEGs。經(jīng)FDR校正的P≤0.05被定義為顯著富集，以Cytoscape生成通路圖形表示。

2 結(jié) 果

2.1 GBM組織與正常腦組織中差異表達的lncRNAs通過對6例正常腦組織和6例GBM組織進行高通量測序，獲得968個差異表達的lncRNAs。與正常腦組織相比，GBM組織中有399個lncRNAs表達上調(diào)，569個lncRNAs表達下調(diào)（圖1）。從中篩選出20個差異表達最顯著的lncRNAs，其中5個表達上調(diào)（表1），15個表達下調(diào)（表2）。

圖1 差異表達LncRNAs火山圖

表1 GBM中顯著上調(diào)的5個lncRNAs

表2 GBM中顯著下調(diào)的15個lncRNAs

2.2 GBM中差異表達的lncRNAs GO富集分析GO分析顯示了與分子功能（MF）、細胞成分（CC）和生物過程（BP）三個類別相關(guān)的條目（圖2A-C），三個類別中10個最豐富的小分類（按富集分數(shù)降序排列）如圖2D-F所示。

2.3 GBM中差異表達的lncRNAs通路富集分析 KEGG通路分析顯示，差異表達的lncRNAs在多個重要通路上顯著富集。圖3A中點圖顯示重要通路8個最高富集分數(shù)（log10pvalue最低），圖3B顯示參與癌癥通路的lncRNA調(diào)控作用。

圖2 差異表達的lncRNA的GO富集分析

3 討 論

隨著新的研究技術(shù)的發(fā)展，越來越多的高通量測序用于分析腫瘤的基因表達，從而在腫瘤中發(fā)現(xiàn)越來越多的lncRNAs[10-11]。王湘玥等[12]通過高通量測序發(fā)現(xiàn)GBM瘤體和瘤周組織差異表達的lncRNA MIR210HG，并證實其可以抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞凋亡，促進細胞增殖、侵襲和遷移，但具體調(diào)控機制有待深入研究。韓艷玲等[13]通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)GBM組織中l(wèi)ncRNA MTHFD2相對表達量明顯高于正常對照組織，進一步研究證實下調(diào)lncRNA MTHFD2表達可降低GBM細胞的增殖和遷移能力，增強對化療藥物替莫唑銨的敏感性，提示其可能為GBM潛在的治療靶標。GBM的預(yù)后不良，主要是由于缺乏準確的生物標志物，對發(fā)病機制缺乏了解，從而導(dǎo)致診斷延遲和治療效果不佳。因此，迫切需要更好地了解膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制，尋找潛在的生物標志物和準確的治療靶點。然而，目前尚無對在GBM中多種差異表達lncRNAs的各種功能進行描述的文獻報道。

圖3 差異表達的lncRNA的通路富集分析

相較于一代測序，二代測序具有通量高，成本低而準確性無較大差別的優(yōu)點。本研究使用高通量測序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)正常組織與GBM組織差異表達的968個lncRNAs，GBM組織中有399個lncRNAs表達上調(diào)，569個lncRNAs表達下調(diào)，從中篩選出20個差異表達最顯著的lncRNAs，其中5個表達上調(diào)，15個表達下調(diào)。尚未有相關(guān)文獻報道這20個差異表達最顯著的lncRNAs在腫瘤中的作用。為了解GBM中差異表達的lncRNAs的功能作用，本研究采用GO富集分析和通路富集分析。GO分析表明，這些lncRNA在與GBM密切相關(guān)的單細胞行為、突觸部分等顯著富集。通路富集化分析也表明，差異表達的lncRNAs在“谷氨酸能突觸”、“Ras信號通路”、“酒精成癮”、“ErbB信號通路”中顯著富集。

無論檢測表達水平的技術(shù)和所使用的樣本大小如何，因為表達是隨機過程，實際的基因表達水平在個體中是可變的，分析數(shù)據(jù)可能不足以反映這些個體的實際表達水平。但是，生物變異性會隨著樣本規(guī)模的增大而降低，我們今后將采用更多的樣本進行進一步研究。

綜上所述，在本研究中與正常組織相比，GBM中存在眾多差異表達的lncRNAs，這些lncRNAs在GBM重要生物學(xué)過程，細胞組分，分子功能以及多種信號通路中顯著富集，為探索新的GBM診療方法提供可靠的研究方向。