周松林，劉 暢，謝慧敏，杜明智，楊述海，韓笑笑，于 彬

（1南通大學(xué)江蘇省神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇226001；2南通大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科；3南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院）

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類物種之間高度保守、長度為19～25個(gè)核苷酸、不編碼蛋白質(zhì)的單鏈RNA分子。miRNA在RNA聚合酶Ⅱ作用下形成初級miRNA，經(jīng)核糖核酸酶作用得到前體miRNA，最后在Dicer酶剪切下成為成熟miRNA。miRNA可以通過抑制翻譯或轉(zhuǎn)錄水平來調(diào)控靶基因的表達(dá)，參與細(xì)胞分化、生長、增殖調(diào)控等重要生命活動(dòng)過程[1]。已發(fā)現(xiàn)在周圍神經(jīng)損傷后大量miRNAs存在差異表達(dá)，在調(diào)節(jié)施萬細(xì)胞表型中發(fā)揮重要作用[2]。

施萬細(xì)胞是周圍神經(jīng)系統(tǒng)主要的膠質(zhì)細(xì)胞，在周圍神經(jīng)發(fā)育、功能和再生中起著重要作用，能沿神經(jīng)突起形成髓鞘。周圍神經(jīng)損傷后施萬細(xì)胞發(fā)生一系列的表型變化，如脫髓鞘和去分化[3]。神經(jīng)再生過程中施萬細(xì)胞先去分化為施萬細(xì)胞祖細(xì)胞，祖細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)分裂、分化、增殖，生成大量施萬細(xì)胞，參與髓鞘碎屑吞噬和Bunger帶的形成，進(jìn)而引導(dǎo)神經(jīng)再生過程。

目前已發(fā)現(xiàn)miRNA與中樞及周圍神經(jīng)損傷和修復(fù)密切相關(guān)。脊髓損傷后miR-21顯著上調(diào)，通過靶向促凋亡基因Fas配體（FasL）、人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）和程序性死亡蛋白4（PDCD4），在限制繼發(fā)細(xì)胞死亡方面發(fā)揮重要作用[4]。miR-124在脊髓損傷時(shí)顯著升高，可作為診斷脊柱創(chuàng)傷后急性脊髓損傷的潛在標(biāo)志物。另外，miRNAs促進(jìn)施萬細(xì)胞的再分化與髓鞘形成而修復(fù)神經(jīng)。在體外施萬細(xì)胞與背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，miR-30c可促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷后施萬細(xì)胞髓鞘形成[5]。miR-221-3p通過下調(diào)對施萬細(xì)胞髓鞘形成至關(guān)重要的NGF1-A結(jié)合蛋白1（Nab1），抑制施萬細(xì)胞的髓鞘形成，miR-221-3p也可促進(jìn)坐骨神經(jīng)損傷后施萬細(xì)胞的增殖和遷移[6]。目前發(fā)現(xiàn)miR-338在很多腫瘤中，如肝癌、黑色素瘤中呈低表達(dá)。本文主要研究miR-338對周圍神經(jīng)損傷及再生過程中施萬細(xì)胞髓鞘形成的影響，尋求周圍神經(jīng)損傷的新治療策略。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑 成年雄性Sprague-Dawley大鼠30只，體重180 g（南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。TRizol試劑（Invitrogen公司，美國），RT試劑（TaKaRa，中國），SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa，中國），Taqman miRNA檢測試劑盒（Life Technologies公司，美國），Ⅰ型膠原酶（Sigma公司，美國），Neurobasal培養(yǎng)基（Thermo Fisher Scientific公司，美國），神經(jīng)生長因子（NGF）（RD Systems公司，美國），L-glu（Invitrogen公司，美國），anti-S100（DAKO公司，美國），Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司，美國），B27補(bǔ)充劑（Thermo Fisher Scientific公司），粘連蛋白（Invitrogen公司，美國），聚L賴氨酸（Sigma公司），Dulbecco’s modified Eagle’s medium（DMEM）（Sigma公司），抗壞血酸（Sigma公司），Triton X-100（Sigma公司），胎牛血清（Sigma公司），miR-338 agomir、miR-338 antagomir及對照（銳博，中國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠坐骨神經(jīng)夾傷模型：大鼠經(jīng)復(fù)合麻醉劑（0.3 mL/100g）腹腔麻醉后，側(cè)臥位固定，常規(guī)備皮、消毒。沿左側(cè)股骨作1 cm切口，暴露坐骨神經(jīng)。無齒鑷鉗夾坐骨神經(jīng)3次，擠壓寬度3 mm，每次10 s，間隔10 s。

1.2.2 RT-qPCR檢測miRNA表達(dá)量：以Trizol法勻漿提取受損傷坐骨神經(jīng)總RNA，隨后使用Prime－Script RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄，Taqman miRNA檢測試劑盒進(jìn)行miRNA檢測。

1.2.3 施萬細(xì)胞原代培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：取1日齡SD大鼠，在后肢外側(cè)切開皮膚，暴露坐骨神經(jīng)，取出約8 mm長坐骨神經(jīng)。經(jīng)胰蛋白酶消化，分離施萬細(xì)胞，再用抗Thy1.1抗體和兔補(bǔ)體去除成纖維細(xì)胞。以施萬細(xì)胞特異性標(biāo)記物anti-S100進(jìn)行免疫染色，最終得到純度接近95%的施萬細(xì)胞。將施萬細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM（DMED+10%FBS+1%PS）。使用Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑分別將miR-338 agomir（20 mmol/L）、agomir-negative control（20 mmol/L）、miR-338 antagomir（100 mmol/L）和antagomir negative control（100 mmol/L）轉(zhuǎn)染施萬細(xì)胞。

1.2.4 施萬細(xì)胞-背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元共培養(yǎng)：從SD大鼠14.5天胚胎中剝離背根神經(jīng)節(jié)（DRG），將單個(gè)DRG轉(zhuǎn)移到無Ca2+/Mg2+的Hank’s緩沖液中。24孔板預(yù)先用多聚L賴氨酸和10 mg/mL層粘連蛋白包被。以0.1%Ⅰ型膠原酶和0.25%胰蛋白酶將DRG消化至單細(xì)胞后，重懸于Neurobasal培養(yǎng)基，添加B27補(bǔ)充劑（1∶50）、100 ng/mL神經(jīng)生長因子和L-glu（1∶100）。用尿苷（10 nmol/L）和氟脫氧尿苷（10 nmol/L）處理細(xì)胞2次，每次48 h，去除非神經(jīng)元細(xì)胞。在與神經(jīng)元共培養(yǎng)前，將miR-338 agomir、miR-338 antagomir轉(zhuǎn)染到施萬細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后施萬細(xì)胞置于含5%胎牛血清和100 ng/mL NGF的DMEM中，培養(yǎng)2 d，以幫助施萬細(xì)胞在DRG突起上粘附。7 d后添加50μg/mL抗壞血酸誘導(dǎo)髓磷脂形成，每2 d重新添加含有抗壞血酸的新鮮培養(yǎng)基維持培養(yǎng)。

1.2.5 免疫熒光染色：收集共培養(yǎng)的DRG和施萬細(xì)胞，4%多聚甲醛室溫固定25 min，0.1%Triton X-100通透10 min，5%BSA室溫封閉30 min，加一抗anti-MBP在4℃過夜，二抗Cy3-conjugated sheep antirabbit IgG在室溫下放置2 h。使用Leica DMi8倒置熒光顯微鏡拍攝照片。

1.2.6 芯片檢測分析：使用mirVanaTM miRNA分離試劑盒、BioAnalyer 210生物分析儀和NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)分別進(jìn)行提取總RNA、質(zhì)檢和量化。Agilent mRNA芯片由上海歐易公司進(jìn)行標(biāo)記和雜交，采用安捷倫掃描控制軟件掃描芯片的照片，安捷倫分析軟件進(jìn)行圖像分析，GeneSpring進(jìn)行微陣列數(shù)據(jù)解讀和初步分析。

2 結(jié) 果

2.1 RT-qPCR定量測定受損傷坐骨神經(jīng)miR-338表達(dá)量 坐骨神經(jīng)橫斷后miR-338表達(dá)水平迅速下調(diào)，在第4天達(dá)到最低水平，在第7天、14天逐漸增加，表明miR-338在損傷后急性期下調(diào)，然后在再生期緩慢恢復(fù)到正常水平。見圖1。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miR-338表達(dá)

2.2 miR-338促進(jìn)施萬細(xì)胞再分化 miR-338 agomir處理的施萬細(xì)胞再分化為髓鞘的效果明顯增強(qiáng)，而miR-338 antiagomir處理的施萬細(xì)胞再分化為髓鞘明顯減少，表明過表達(dá)miR-338可促進(jìn)施萬細(xì)胞再分化為髓鞘，miR-338可能在髓鞘形成過程中具有積極作用。見圖2。

2.3 過表達(dá)miR-338對施萬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響 通過熱火圖對過表達(dá)miR-338后施萬細(xì)胞中的差異基因進(jìn)行聚類，發(fā)現(xiàn)463個(gè)上調(diào)基因和194個(gè)下調(diào)基因。通過基因本體（gene ontology，GO）數(shù)據(jù)庫對上調(diào)基因行使的分子功能和參與的生物學(xué)過程進(jìn)行聚類，發(fā)現(xiàn)差異上調(diào)基因功能富集最顯著的GO與髓鞘形成相關(guān)。見圖3。

3 討 論

圖2 miR-338促進(jìn)施萬細(xì)胞髓鞘形成

日常生活中神經(jīng)損傷非常普遍，中樞神經(jīng)再生能力有限，而周圍神經(jīng)具有一定的再生能力。研究表明，miRNAs能通過調(diào)控施萬細(xì)胞而重塑再生微環(huán)境。miR-34a和miR-140是施萬細(xì)胞增殖和髓鞘形成的重要功能調(diào)控因子[7]；miR-338能夠調(diào)控軸突定位的COXIV，導(dǎo)致線粒體活性下降。通過測量細(xì)胞耗氧量和ATP水平的降低，確定miR-338存在于軸突之中[8]。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)miR-9通過直接靶向CTHRC1的3’-UTR而顯著下調(diào)CTHRC1表達(dá)，從而調(diào)控施萬細(xì)胞的遷移作用[9]；miR-221/222通過靶向長壽保證同源物2（LASS2）促進(jìn)雪旺細(xì)胞的增殖和遷移[10]；miR-3075靶向接觸蛋白2（CNTN2）抑制施萬細(xì)胞的遷移；miR-sc3通過靶向星形肌動(dòng)蛋白1（astrotactin1，ASTN1）來促進(jìn)施萬細(xì)胞的增殖和遷移，而miR-sc4和miR-sc8通過靶向周期蛋白依賴性激酶5激活因子1（CDK5R1）和表皮生長因子受體（EGFR）來抑制施萬細(xì)胞的增殖和遷移[11]。let-7和miR-9分別通過靶向人軸突生長誘向因子1（Ntn1）和結(jié)直腸癌缺失基因（DCC），確保受損軸突朝著正確方向增殖[12]。孤兒核受體3（NR4A3）是PI3K-mTOR通路的負(fù)調(diào)控因子，miR-20a通過靶向NR4A3促進(jìn)體外DRG神經(jīng)元的神經(jīng)突生長和體內(nèi)損傷后的軸突再生[13]。另外，miRNAs可調(diào)控少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化和髓鞘形成過程[14]。目前發(fā)現(xiàn)miRNA的加工是促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞正常分化和髓鞘形成所必需的[15]。miR-338和miR-219對少突膠質(zhì)細(xì)胞分化具有疊加作用，并且是髓鞘完整形成所必需的[16]。

圖3 過表達(dá)miR-338對施萬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響

以前有研究證實(shí)miR-338可促進(jìn)中樞少突膠質(zhì)細(xì)胞成髓鞘[17]，但miR-338在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，在SD大鼠坐骨神經(jīng)損傷后miR-338促進(jìn)施萬細(xì)胞成髓鞘，通過分析坐骨神經(jīng)橫斷后不同時(shí)間點(diǎn)的近端神經(jīng)殘段，發(fā)現(xiàn)miR-338表達(dá)量先下調(diào)，第4天后表達(dá)量逐漸上調(diào)，表明miR-338在神經(jīng)損傷后的再生中可能發(fā)揮作用。原代培養(yǎng)的施萬細(xì)胞與DRG神經(jīng)元共培養(yǎng)試驗(yàn)顯示，過表達(dá)miR-338促使施萬細(xì)胞的髓鞘形成，過表達(dá)miR-338后差異基因功能富集最顯著的GO與髓鞘形成有關(guān)。miR-338可以促進(jìn)施萬細(xì)胞再分化，有助于更好了解miRNAs在神經(jīng)再生中的調(diào)控作用，為神經(jīng)損傷的治療提供新的途徑。