李 陳(綜述)，肖玉周(審校)

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科，安徽 蚌埠 233000)

施萬細胞是周圍神經(jīng)所特有的一種膠質(zhì)細胞，主要功能是對軸突提供支持與保護、形成髓鞘，并且能分泌多種活性物質(zhì)(如神經(jīng)營養(yǎng)因子、細胞外基質(zhì)及黏附因子等)，這些活性物質(zhì)對維持神經(jīng)纖維的存活、生長以及損傷后的再生具有重要的生物學(xué)作用[1]。目前，以移植施萬細胞治療神經(jīng)損傷及誘導(dǎo)神經(jīng)鞘再生的組織工程學(xué)成為研究的熱點[2]。在周圍神經(jīng)的軸突損傷后，施萬細胞從損傷神經(jīng)遠側(cè)端清除軸突和髓鞘崩解物，同時施萬細胞可分泌促神經(jīng)再生的各類因子，為軸突營造適宜的再生環(huán)境[3]。因此，施萬細胞是組織工程中種子細胞的最佳選擇。但在組織工程實施過程中，高純度的施萬細胞需求往往很大，因此其體外培養(yǎng)、純化、擴增顯得至關(guān)重要。

1 施萬細胞的來源與取材

1.1細胞來源 施萬細胞的傳統(tǒng)來源主要是從鼠、兔、猴等哺乳動物的胚胎或新生動物取材，但動物來源的施萬細胞作為種子細胞在臨床應(yīng)用時卻受到相對的受限，近年來研究的重點放在人來源的施萬細胞上，能夠更有效的減少免疫排異反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，直接從新鮮的周圍神經(jīng)取材進行施萬細胞的培養(yǎng)產(chǎn)量較低，很難達到實際的需求[4-5]。大多數(shù)的研究人員采用預(yù)變性的周圍神經(jīng)作為取材對象，施萬細胞在成年動物周圍神經(jīng)被切斷后的Waller變性的早期大量增殖，許多學(xué)者通過對成年動物周圍神經(jīng)進行預(yù)變性來獲得更多數(shù)量的施萬細胞，因為神經(jīng)損傷后巨噬細胞能夠分泌生長因子，能促進施萬細胞分裂[6]。

1.2取材 施萬細胞的主要取材部位有：正中神經(jīng)、坐骨神經(jīng)等混合神經(jīng)以及背根神經(jīng)節(jié)等，且實驗表明運動與感覺神經(jīng)來源的施萬細胞分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子不同，至于何種來源的施萬細胞治療效果明顯，還有待探索[7]。取材過程中關(guān)鍵在于去除參雜的成纖維細胞，由于其主要存在于神經(jīng)外膜和神經(jīng)束膜中，應(yīng)盡可能去除這些成分。

2 施萬細胞培養(yǎng)方法

2.1植塊法 植塊法原理是成纖維細胞的增殖速度要比施萬細胞快，通過反復(fù)的貼壁便可以獲得較高純度的施萬細胞。此方法培養(yǎng)的周期較長，且培養(yǎng)過程中伴隨著細胞活性及分裂能力的下降。有人在此基礎(chǔ)上做出了改進，采用直接植塊法和反復(fù)植塊法，即將施萬細胞種植于鼠尾膠包埋的共聚物支架上，減少了反復(fù)消化離心和差速貼壁造成的對細胞生長周期的影響，從而使培養(yǎng)的施萬細胞保持穩(wěn)定的生物學(xué)功能[8]。在此基礎(chǔ)上反復(fù)多次，就是反復(fù)植塊法。

2.2酶消化法 酶消化法的主要原理是用酶去除組織中的間質(zhì)，使組織更為分散而使細胞呈單層排列。Qin等[9]將植塊反復(fù)種植法和酶消化法聯(lián)合使用，用0.25%Ⅴ型膠原酶和0.03%胰蛋白酶消化出生3 d 的SD大鼠鼠臂層神經(jīng)和坐骨神經(jīng)組織塊40 min，再將組織塊貼壁培養(yǎng)。采用組織塊反復(fù)種植純化法、低濃度胰酶快速消化和差速貼壁法對施萬細胞進行純化，結(jié)果施萬細胞活性較高，純度可達90%以上，細胞所受到的外界因素影響也較少。

2.3三維培養(yǎng)法 植塊法、酶消化法主要是基于二維培養(yǎng)方法，然而體外細胞培養(yǎng)的一個重要原則是需模擬體內(nèi)細胞生長環(huán)境，該模擬系統(tǒng)中最重要的核心因素是細胞與培養(yǎng)環(huán)境之間的相互作用。不同于傳統(tǒng)的二維化單層細胞培養(yǎng)，三維細胞培養(yǎng)技術(shù)是將具有三維結(jié)構(gòu)不同材料的載體與各種不同種類的細胞在體外共同培養(yǎng)，使細胞能夠在載體的三維立體空間結(jié)構(gòu)中遷移、生長，構(gòu)成三維的細胞載體復(fù)合物。三維細胞培養(yǎng)是將細胞培植在一定的細胞外基質(zhì)中，細胞外基質(zhì)蛋白充當生長支架，使得細胞能夠分化產(chǎn)生一定的三維組織特異性結(jié)構(gòu)，所創(chuàng)建的細胞生長環(huán)境則最大程度地模擬體內(nèi)環(huán)境[10]。在施萬細胞的培養(yǎng)中也有學(xué)者采用該方法進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中放入三維支架，使細胞貼壁，形成Bungner帶，支架的主要材料是膠原，其次還有聚酯纖維、聚乳酸等[11]。Moradi等[12]采用三維自組裝多肽水凝膠作為基質(zhì)三維培養(yǎng)人胎兒施萬細胞，結(jié)果培養(yǎng)出的施萬細胞活性較高，細胞形態(tài)更加典型，且0.25%水凝膠效果最佳，能夠形成良好的形成納米纖維支架結(jié)構(gòu)。

3 施萬細胞純化方法

植塊法和酶消化法是施萬細胞培養(yǎng)的最經(jīng)典的兩種方法，雖然其操作簡便，但是所獲得的細胞中容易混有雜質(zhì)細胞(主要是成纖維細胞)。為此，人們在這兩種方法的基礎(chǔ)上不斷改進，有了一系列除去成纖維細胞的提純方法。

3.1抗有絲分裂法 抗有絲分裂劑有阿糖胞苷等，能夠?qū)期細胞產(chǎn)生特異性殺傷，并且能抑制DNA多聚酶，干擾DNA的合成與復(fù)制。Wei等[13]采用阿糖胞苷處理細胞24 h，然后將培養(yǎng)基更換為含0.02 μg/L外源性生長因子處理48 h，最后采用差速貼壁法，經(jīng)過10 d的原代培養(yǎng)，進行傳代，最終第5代施萬細胞的純度可達到99%。也有報道顯示，這些抗有絲分裂劑缺乏特異性，會對施萬細胞產(chǎn)生一定的毒性，會阻斷神經(jīng)生長因子轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響神經(jīng)的再生，因此不適合在臨床上推廣[14]。

3.2免疫選擇純化法 胸腺嘧啶1(thymine-1，Thy-1)抗原特異性表達于成纖維細胞，通過反復(fù)使用Thy-1抗體，結(jié)合補體介導(dǎo)的細胞裂解利用，能夠培養(yǎng)出高純度的施萬細胞[4-5]。Nash等[15]通過向培養(yǎng)液中加入抗Thy-1抗原，37 ℃孵育30 min，然后轉(zhuǎn)到含免疫球蛋白G的培養(yǎng)基上，成纖維細胞黏附到培養(yǎng)基上，最后將施萬細胞重新吸出，原代培養(yǎng)10 d，純度可達90%，第5代純度高達99%；細胞密度為2×107L-1。然而，該方法存在著培養(yǎng)效率低、費時費力、價格昂貴等劣勢，很難在臨床上推廣。

3.3免疫磁珠法 免疫磁珠是一項新的免疫學(xué)技術(shù)，它運用核-殼的合成方法合成含有四氧化三鐵超順磁性的高分子表面覆蓋高分子，其穩(wěn)定性好，能進行后期標記，利用這些物質(zhì)表面的功能基團(如氨基、羧基、巰基等)進行抗體的共價或者非共價偶聯(lián)，可用于結(jié)合施萬細胞表面特有的標記抗原p75抗原，這樣在外加磁場的吸引下可作定向移動，從而達到分離提純施萬細胞的目的。Vroemen等[16]應(yīng)用該方法，經(jīng)過9 d的原代培養(yǎng)后分離出了純度為95%的施萬細胞，細胞密度為1×107L-1。黃明等[17]在免疫磁珠法基礎(chǔ)上加以改進，采用雙酶2次法培養(yǎng)施萬細胞，7 d后應(yīng)用免疫磁珠法對細胞進行純化培養(yǎng)，純化后施萬細胞純度為98.0%，培養(yǎng)2 d后就可以傳代。使用具有抗Thy-1標記的磁珠，除去成纖維細胞已有報道[18]。然而，這種方法也面臨著費時、價格昂貴等的特點。

3.4神經(jīng)刺激因子純化法 在正常施萬細胞培養(yǎng)的過程中加入刺激因子，如牛垂體抽提物(bovine pituitary extract，BPE)，BPE含有多種生長因子(如內(nèi)源性堿性成纖維細胞生長因子1神經(jīng)生長因子等)，這些生長因子也具有激活腺苷環(huán)化酶的活性，它們可以通透細胞，激活腺苷酸環(huán)化酶，從而升高細胞內(nèi)的環(huán)腺苷酸水平，能夠促進施萬細胞的有絲分裂，促進施萬細胞增殖的作用。趙勇等[19]將成年兔發(fā)生Wallerian變性的雙側(cè)坐骨神經(jīng)剪碎至1 mm3的植塊，反復(fù)差速貼附法進行培養(yǎng)，同時用內(nèi)源性堿性成纖維細胞生長因子、forskolin刺激增殖，結(jié)果可獲得施萬細胞的純度達94%以上。由于這些刺激因子的特異性不強，在促進施萬細胞有絲分裂的同時也會促進成纖維細胞的生長。

3.5條件培養(yǎng)基純化法D-氨基酸氧化酶基因在施萬細胞的水平顯著高于成纖維細胞，其能夠分解利用D-纈氨酸[20]。因此，利用此原理能夠達到純化施萬細胞的目的。Kaewkhaw等[21]采用預(yù)變性7D的大鼠坐骨神經(jīng)，然后去除外膜，游離組織酶，然后在改良杜氏伊格爾培養(yǎng)液(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)-D-纈氨酸中培養(yǎng)，DMEM培養(yǎng)液中加入促有絲分裂因子，包括Forskolin、胎牛血清和BPE，結(jié)果：原代施萬細胞純度為97.3%，第2代純度達98.3%，經(jīng)過培養(yǎng)19 d后細胞密度為1.2×108L-1。該方法特點為產(chǎn)量高、純度高、細胞活性高、培養(yǎng)操作簡便等，但培養(yǎng)周期較長。

3.6層粘連蛋白純化法 由于施萬細胞在生長過程中會黏附在基膜上，而層粘連蛋白是基膜的主要成分，施萬細胞對于層粘連蛋白有著很強的親和力，因此將層粘連蛋白包被在培養(yǎng)基的底物上，然后將分離的施萬細胞添加到培養(yǎng)基中，施萬細胞將會先于成纖維細胞結(jié)合到培養(yǎng)基中，這樣經(jīng)歷幾個循環(huán)，就可以獲得純度較高的施萬細胞。Pannunzio等[22]應(yīng)用該方法，經(jīng)過5代培養(yǎng)，得到的施萬細胞純度可達90%左右。該方法純化細胞的周期較短，但純度相對較低。

3.7非特異性的純化方法 非特異性的純化方法很常見，如冷噴射法，該方法是利用在較冷環(huán)境中不同細胞貼壁能力的不同，采用預(yù)冷的磷酸緩沖液沖擊貼壁細胞，使某種細胞先脫落，而達到純化細胞的目的。研究表明，施萬細胞較成纖維細胞黏附性弱，將首先被沖下來，將其搜集起來繼續(xù)培養(yǎng)，從而達到純化施萬細胞的目的[23]。該方法由Jirsová等[24]首先報道，選取15 d齡大鼠，分離背根神經(jīng)節(jié)，采用酶消化法處理組織，待細胞長滿后以冷噴射法提純施萬細胞，一次純化細胞純度可達到95%，并可在之后的純化中使施萬細胞純度達到99%以上。Mauritz等[25]也采用該方法并采用預(yù)變性的大鼠坐骨神經(jīng)，培養(yǎng)基中加入BPE、forskolin、成纖維生長因子2，采用冷噴射法去除成纖維細胞，經(jīng)過21 d的原代培養(yǎng)，融合度達到80%傳代，第2代純度達69%，第3代達94%，且細胞密度較高，達1.2×108L-1。該方法有操作方便，不必使用細胞毒性化學(xué)試劑，且純化效果好等優(yōu)點。冷噴射法的不足：最主要的是該方法對溫度要求較高，高的環(huán)境溫度會使4 ℃的冷噴射液快速升溫，使施萬細胞難以被噴射液吹落；而加大噴射力度勢必造成成纖維細胞的脫落，難以達到純化的目的。李爽等[26]在經(jīng)典冷噴射法的基礎(chǔ)上對其進行改良，對施萬細胞采用冰浴處理，使培養(yǎng)液快速降低到接近冰水混合物的溫度，克服了溫度對實驗效果造成的影響。

4 小 結(jié)

近年來隨著醫(yī)學(xué)的長足發(fā)展，用組織工程學(xué)的方法來修復(fù)損傷神經(jīng)成為一種趨勢，施萬細胞作為周圍神經(jīng)所特有的膠質(zhì)細胞，其在周圍神經(jīng)發(fā)育與再生過程中的特殊作用，使其成為組織工程中重要的種子細胞，越發(fā)引起學(xué)者們的重視。高純度、高活性的施萬細胞成為組織工程技術(shù)在臨床成功應(yīng)用的保證，現(xiàn)如今人們對其培養(yǎng)與純化技術(shù)已經(jīng)有了一定程度的探索，但是目前還存在著如純度低、周期長、活性弱等方面的不足，希望在不遠的將來能夠攻破這些難關(guān)，更好地造福于人類。

[1] Zujovic V,Doucerain C,Hidalgo A,etal.Exogenous Schwann cells migrate,remyelinate and promote clinical recovery in experimental auto-immune encephalomyelitis[J].PLoS One,2012,7(9):e42667.

[2] Rodrigues MC,Rodrigues AA Jr,Glover LE,etal.Peripheral nerve repair with cultured schwann cells:getting closer to the clinics[J].ScientificWorldJournal,2012,2012:413091.

[3] Bremer J,O′Connor T,Tiberi C,etal.Ablation of Dicer from murine Schwann cells increases their proliferation while blocking myelination[J].PLoS One,2010,5(8):e12450.

[4] Brockes JP,Fields KL,Raff MC.Studies on cultured rat Schwann cells.I.Establishment of purified populations from cultures of peripheral nerve[J].Brain Res,1979,165(1):105-118.

[5] Needham LK,Tennekoon GI,McKhann GM.Selective growth of rat Schwann cells in neuron-free and serum-free primary culture[J].J Neurosci,1987,7(1):1-9.

[6] Kaiser R,Haninec P.Degeneration and regeneration of the peripheral nerve[J].Cesk Fysiol,2012,61(1):9-14.

[7] Wang S,Fan Z,Shen Y.Study of isolation and purification of primary Schwann cells from different parts of nerve tissue in rats[J].Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi,2011,25(2):166-170.

[8] Haastert-Talini K.Culture and proliferation of highly purified adult Schwann cells from rat,dog,and man[J].Methods Mol Biol,2012,846:189-200.

[9] Qin Y,Zhao J,Su W.Experimental study on culturing Schwann cells of rats by single-enzyme digestion and explant-culture method[J].Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi,2012,26(9):1107-1111.

[10] Yuan JD,Nie WB,Fu Q,etal.Novel three-dimensional nerve tissue engineering scaffolds and its biocompatibility with Schwann cells[J].Chin J Traumatol,2009,12(3):133-137.

[11] Allodi I,Guzmán-Lenis MS,Hernàndez J,etal.In vitro comparison of motor and sensory neuron outgrowth in a 3D collagen matrix[J].J Neurosci Methods,2011,198(1):53-61.

[12] Moradi F,Bahktiari M,Joghataei MT,etal.BD PuraMatrix peptide hydrogel as a culture system for human fetal Schwann cells in spinal cord regeneration.[J].J Neurosci Res,2012,90(12):2335-2348.

[13] Wei Y,Zhou J,Zheng Z,etal.An improved method for isolating Schwann cells from postnatal rat sciatic nerves[J].Cell Tissue Res,2009,337(3):361-369.

[14] Anand U,Otto WR,Bountra C,etal.Cytosine arabinoside affects the heat and capsaicin receptor TRPV1 localisation and sensitivity in human sensory neurons[J].J Neurooncol,2008,89(1):1-7.

[15] Nash HH,Borke RC,Anders JJ.New method of purification for establishing primary cultures of Schwann cells from the adult olfactory bulb[J].Glia,2001,34(2):81-87.

[16] Vroemen M,Weidner N.Purification of Schwann cells by selection of p75 low affinity nerve growth factor receptor expressing cells from adult peripheral nerve[J].J Neurosci Methods,2003,124(2):135-143.

[17] 黃明,羅卓荊,肖偉,等.免疫磁珠法分離和提純雪旺細胞的實驗研究[J].中國矯形外科雜志.2008,16(8):599-601.

[18] Haastert K,Seef P,Stein VM,etal.A new cell culture protocol for enrichment and genetic modification of adult canine Schwann cells suitable for peripheral nerve tissue engineering[J].Res Vet Sci,2009,87(1):140-142.

[19] 趙勇,初同偉,周躍.成年兔雪旺細胞體外培養(yǎng)增殖和純化的實驗研究[J].江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2008,48(1):22-25.

[20] Kaewkhaw R,Scutt AM,Haycock JW.Anatomical site influences the differentiation of Adipose derived stem cells for Schwann cell phenotype and function[J].Glia,2011,59(5):734-749.

[21] Kaewkhaw R,Scutt AM,Haycock JW.Integrated culture and purification of rat Schwann cells from freshly isolated adult tissue[J].Nat Protoc,2012,7(11):1996-2004.

[22] Pannunzio ME,Jou IM,Long A,etal.A new method of selecting Schwann cells from adult mouse sciatic nerve[J].J Neurosci Methods,2005,149(1):74-81.

[23] Raabe TD,Clive DR,Neuberger TJ,etal.Cultured neonatal Schwann cells contain and secrete neuregulins[J].J Neurosci Res,1996,46(2):263-270.

[24] Jirsová K,Sodaar P,Mandys V,etal.Cold jet:a method to obtain pure Schwann cell cultures without the need for cytotoxic apoptosis inducing drug treatment[J].J Neurosci Methods,1997,78(1/2):133-137.

[25] Mauritz C,Grothe C,Haastert K.Comparative study of cell culture and purification methods to obtain highly enriched cultures of proliferating adult rat Schwann cells[J].J Neurosci Res,2004,77(3):453-461.

[26] 李爽,馬信龍,孫曉雷,等.改良冷噴注法純化大鼠雪旺細胞的實驗研究[J],中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志,2011,10(10):1000-1004.