李 嘉，高 玲，施楊婉玲，田源紅，楊孝芳，陳迎龍

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴陽 550025)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)以肝組織細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的過度增生和異常沉積為病理基礎(chǔ)，是各種慢性肝病導(dǎo)致的共同結(jié)果，其病因包括病毒感染、膽汁瘀積以及酒精和藥物損傷等，若不能進(jìn)行有效治療，最終會導(dǎo)致肝衰竭、門脈高壓甚至危及生命[1]。研究表明，早期的HF是可逆的[2-3]，其中肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)的活化是HF發(fā)生的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，目前許多藥物主要以誘導(dǎo)活化的HSCs凋亡作為防治HF的有效靶點[4]。馬蘭草作為貴州特色道地苗藥材，在民間常煎服用于治療傳染性肝炎、水腫、黃疸等，其性味辛、苦、寒，歸肺經(jīng)、肝經(jīng)、胃經(jīng)、大腸經(jīng)，有清熱解毒、散瘀止血消積之功。課題組前期研究初步發(fā)現(xiàn)，中藥口服辨證組方可改善肝硬化腹水大鼠線粒體能量代謝，馬蘭草臍灸對肝硬化腹水大鼠肝功能、線粒體有影響作用[5]。故本研究擬將馬蘭草絨制作為灸材，通過灸臍干預(yù)來觀察HF大鼠肝組織結(jié)構(gòu)的病理改變與相關(guān)因子的表達(dá)變化。本實驗已通過貴州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審查。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量(180±220) g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心實驗室提供，實驗動物許可證號SCXK(粵)2016-0020。

1.2 藥物及制備

苯巴比妥片(國藥準(zhǔn)字H31022038)，上海信宜藥廠有限公司；秋水仙堿片(國藥準(zhǔn)字H53021369)，西雙版納藥業(yè)有限公司。課題組前期選取貴陽市花溪區(qū)干燥的馬蘭草藥材，剪碎并精密稱取100 g加蒸餾水1000 mL，精密吸取馬蘭草揮發(fā)油0.025 mL制備供試品溶液，并進(jìn)行色譜條件與方法學(xué)考察對藥材粉碎粒度的燃燒時間、速率進(jìn)行考察及燃燒及煙霧量的測定，最終確定馬蘭草絨的制備工藝：將馬蘭全草粉碎過40目藥篩即得。本研究將適量馬蘭全草灸絨制作為灸柱置于大鼠臍處施灸。

1.3 試劑及儀器

CCl4(分析純,批號2008121)，江蘇強(qiáng)盛化工有限公司；橄欖油(批號LB-10-100627005344)，隴南市祥宇油橄欖開發(fā)有限責(zé)任公司；多聚甲醛(P0099)、山羊血清(批號C0265)、DAPI(批號C1005)、TritonX-100(批號ST795)、抗熒光淬滅劑(批號P0126)，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Bax一抗(批號Ab32503)，英國Abcam公司；Bcl-2一抗(批號Ab32124)，英國Abcam公司；COX活性檢測試劑盒(批號HL10014.3.1)，上海哈靈生物科技有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(批號KGA1045)，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；BCA試劑盒(批號20181015)，中日合資Solarbio公司。

Precisa12 A型電子分析天平(瑞士公司，BSA224S，萬分之一)；DHG-9240 A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；Mini PROTEAN Tetra Cell型垂直電泳儀(美國Bio-Rad)；CFX96型熒光定量儀(美國Bio-Rad公司)；CKK53型倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；TCS-SP8型激光共聚焦成像系統(tǒng)(德國Leica公司)；HB-RO/60型超純水儀(美國Millipore公司)；RM2235、HI1210和HI1220型切片機(jī)、展片機(jī)和烤片機(jī)(德國Leica公司)。

2 方法

2.1 動物分組及建模

所有大鼠實驗室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分成空白組、模型組、馬蘭草臍灸組、秋水仙堿組4組各10只。各組同期造模，實驗第1天除空白組大鼠外，其余各組大鼠均皮下注射40% CCl4橄欖油，注射劑量5.0 mL/kg(注射劑量/大鼠體質(zhì)量)，以后每周3次皮下注射40% CCl4橄欖油，注射劑量3.0 mL/kg (注射劑量/大鼠體質(zhì)量)，連續(xù)8周直至動物處死前1 d。

2.2 干預(yù)方法

空白組正常喂食喂水,抓取大鼠放入自制大鼠固定器仰臥位固定，固定時間同馬蘭草灸組大鼠施灸時間，連續(xù)干預(yù)8周直至動物處死前1 d。模型組抓取大鼠放入自制大鼠固定器仰臥位固定，固定時間同馬蘭草灸組大鼠施灸時間，連續(xù)干預(yù)8周直至動物處死前1 d。馬蘭草臍灸組：馬蘭草灸神闕穴，每次每穴3壯。大鼠神闕取穴按照《實驗針灸學(xué)》[6]并結(jié)合人體穴位的模擬位置取穴。穴位位于大鼠胸腹正中線，胸骨柄上緣至外生殖器連線的上3/4及下1/4交界處。穴位選定后剪毛，施灸時涂凡士林以保護(hù)小鼠皮膚且便于固定艾炷。馬蘭草灸炷做得緊而結(jié)實(底座直徑2 mm，高度5 mm，質(zhì)量3～15 mg)，用線香點燃，每壯時間為18～20 s，當(dāng)小鼠掙扎時更換，每次3壯，連續(xù)干預(yù)8周直至動物處死前1 d。秋水仙堿組(將秋水仙堿藥片磨碎,制成水溶液,每1 mL水中含0.1 mg秋水仙堿)5.0 mL/kg(秋水仙堿含量/大鼠體質(zhì)量)灌胃,每日1次,首次造模次日開始給藥，藥物濃度及等效劑量按體質(zhì)量折算，連續(xù)干預(yù)8周直至動物處死前1 d。

2.3 取血及取材

自首次造模開始計算日期，于第8周末當(dāng)晚大鼠禁食不禁水12 h，次日上午最后1次稱取體質(zhì)量后，用10%水合氯酸3.0 mL/kg大鼠體質(zhì)量腹腔注射麻醉，手術(shù)臺固定大鼠，用手術(shù)剪刀打開腹腔，真空采血管腹主動脈取血保存，做離心取血清準(zhǔn)備工作。提取肝臟(全部6片肝葉)4 ℃生理鹽水沖洗，去除薄膜和殘留組織,稱肝臟質(zhì)量,每組各取3只大鼠肝臟全部浸泡于10%中性福爾馬林做肝臟外觀觀察使用，剩余全部肝臟用錫紙包裹標(biāo)記后裝入布袋中，放入液氮保存?zhèn)錂z其他指標(biāo)。每組大鼠隨即挑選3只，于肝右葉離邊緣1 cm處切取1塊肝組織(0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm)，10%中性福爾馬林固定，做石蠟切片準(zhǔn)備。所釆血樣4 ℃靜置2 h后，3000 rpm離心10 min分離血清，舍棄出現(xiàn)溶血現(xiàn)象的血清，其余分裝EP管，放入液氮保存?zhèn)錂z其他指標(biāo)。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 觀察大鼠外觀情況及肝臟大體形態(tài) 每日觀察大鼠生長、進(jìn)食、進(jìn)水、毛色、糞便、活動、死亡情況，觀察肝臟大體形態(tài)如體積、色澤、切口等。

2.4.2 血清肝功能指標(biāo)測定 采集門靜脈采血2 ml，將血樣進(jìn)行低溫離心分離，取上清液，用全自動生化儀檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、白蛋白(ALB)。

2.4.3 肝組織蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE) 石蠟切片行HE染色，按照常規(guī)方法脫離、染色、透明和封固，鏡下觀察組織形態(tài)。

2.4.4 肝組織羥脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)含量和細(xì)胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase, COX)活性測定 冰凍肝組織用于檢測Hyp含量，根據(jù)Hyp測試盒的說明書操作。另取新鮮肝組織用電動勻漿器制備勻漿液,勻漿液緩沖成分(mmol/l)蔗糖250，Tris-Hcl5、EDTA1、PH值7.4。將勻漿液離心2000 g/10 min棄沉淀收集上清,重復(fù)離心收集上清,再離心12000 g/15 min，收集沉淀即得線粒體。取10ul制備好的線粒體懸浮液，將含亞鐵細(xì)胞色素C的反應(yīng)底物加入，使亞鐵細(xì)胞色素C氧化成高鐵細(xì)胞色素C，按試劑盒介紹步驟使用分光光度法進(jìn)行測定。

2.4.5 免疫印跡法(western blotting,WB)檢測肝組織中B細(xì)胞淋巴瘤-2 (b-cell lymphoma-2, Bcl-2)、相關(guān)X蛋白(bcl-2 associated x protein, Bax)蛋白表達(dá) 蛋白裂解測定濃度，加樣60μg蛋白緩沖，沸水浴5 min，配置10%分離膠和5%的濃縮膠，上樣電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。封閉1 h，加入稀釋一抗(TBST溶解的5%BSA)(兔抗Bax單克隆一抗1∶2000，兔抗Bcl-2單克隆一抗1∶1000)，4 ℃過夜;TBST洗3次，每次5 min;加入稀釋二抗(TBST溶解5%脫脂牛奶)(HRP山羊抗兔IgG二抗1∶10000)，室溫下孵育30 min，TBST洗3次，每次5 min，采用ECL法顯影曝光。

2.4.6 免疫熒光檢測肝組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 蒸餾水清洗后浸泡PBS 5 min，組織切片滴加0.5% TritonX-100室溫打孔60 min，PBS漂洗3 min×3次，加入5%正常山羊血清封閉1 h，加入一抗(1∶200)濕盒4 ℃孵育過夜，室溫孵育1 h，PBS漂洗3 min×3次，加入熒光二抗(1∶300)濕盒37 ℃孵育1 h。于暗處濕盒37 ℃孵育1 h，PBS漂洗3 min×3次，加入一抗(1∶200)濕盒37 ℃孵育1 h，PBS漂洗3 min×3次，加入熒光二抗488(1∶300)濕盒37 ℃孵育1 h，PBS漂洗3 min×3次，滴加DAPI避光孵育15 min，PBS 5 min×4次，洗去多余的DAPI，于激光掃描聚焦顯微鏡下(200X)觀察采集圖像。

2.4.7 dUTP缺口末端標(biāo)記方法(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,Tunel)-α-平滑肌動蛋白(smooth muscle actin, α-SMA)熒光雙染檢測活化HSCs凋亡情況 爬片PBS漂洗3 min×3次后吸干，6%山羊血清封閉30 min，分別滴加1∶100稀釋的Anti α-SMA于濕盒4 ℃孵育過夜。37 ℃復(fù)溫45 min，滴加1∶300的熒光二抗Anti488，濕盒室溫孵育1 h，加0.01 M TBS 1∶200 新鮮稀釋Proteinase K 37 ℃消化15 min。按每張切片取TdT和DIG-d-UTP各1 μL，加入18 μL標(biāo)記緩沖液中混勻，甩去切片上多余液體后加20 μL/片標(biāo)記液，置樣品于濕盒中，37 ℃標(biāo)記2 h，0.01 M TBS 洗2 min×3 次。封閉液50 μL/片，室溫30 min后甩掉封閉液，用抗體稀釋液1∶100稀釋生物素化抗地高辛抗體：(取1 ml抗體稀釋液加生物素化抗地高辛抗體10 μL)，混勻后50 μL/片加至標(biāo)本片上。置樣品于濕盒中，37 ℃反應(yīng)30 min，抗體稀釋液1∶100稀釋SABC-CY3，37 ℃反應(yīng)30 min，滴加DAPI避光孵育3 min，核染，浸洗3 min×3次后封片，于激光掃描聚焦顯微鏡下(200X)觀察采集圖像。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況及肝臟大體形態(tài)

空白組大鼠活躍，進(jìn)食飲水正常，毛色光亮潤澤，反應(yīng)靈敏，體質(zhì)量正常均勻，無動物死亡，大便成顆粒狀。模型組反應(yīng)遲鈍，造模后進(jìn)食量和飲水減少，毛色晦暗、蓬松，體質(zhì)量降低，活動受阻，糞便常見拉稀，無動物死亡；馬蘭草臍灸組和秋水仙堿組各指標(biāo)均有明顯好轉(zhuǎn)。

圖1示，空白組大鼠肝臟呈紫紅色，質(zhì)地柔軟潤澤；模型組肝臟呈鮮紅色，質(zhì)地干硬；馬蘭草臍灸組肝臟呈深褐色較潤澤；秋水仙堿組呈半紫紅半深褐色較潤澤。

圖1 大鼠肝臟大體形態(tài)比較

3.2 血清肝功能指標(biāo)檢測

表1示，與空白組大鼠比較，模型組大鼠血清ALT、AST水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，馬蘭草臍灸組和秋水仙堿組ALT、AST水平均明顯降低(P<0.05)，各組ALB水平變化均不明顯(P<0.05)。

表1 血清肝功能指標(biāo)檢測比較

3.3 HF大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察

圖2示，空白組肝臟HE染色結(jié)構(gòu)完整清晰，細(xì)胞大小均勻，無變形壞死，細(xì)胞核明顯；模型組可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞向脂肪變性；馬蘭草臍灸組可見炎性細(xì)胞減少，變性的脂肪細(xì)胞逐漸恢復(fù)；秋水仙堿組與馬蘭草臍灸組相似，可見脂肪細(xì)胞變性減少，有少量炎癥細(xì)胞。

注：空白組;模型組;馬蘭草臍灸組;秋水仙堿組圖2 HF大鼠肝組織HE染色(DAB×200)

3.4 肝組織中Hpy含量、線粒體COX活性測定

表2示，與空白組比較，模型組大鼠肝組織Hyp含量和COX水平均顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，馬蘭草臍灸組和秋水仙堿組大鼠肝組織Hyp含量和COX水平均有顯著下降(P<0.05)。

表2 Hpy含量、線粒體COX活性比較

3.5 Western Blotting檢測大鼠肝組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

圖3圖4示，與空白組比較，模型組的Bcl-2有顯著上升(P<0.05)，Bax表達(dá)顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，馬蘭草臍灸組的Bcl-2表達(dá)有顯著下降(P<0.05)，Bax表達(dá)顯著上升(P<0.05)，秋水仙堿組的Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)均有所上升(P<0.05)。

圖3 Western Blotting檢測大鼠肝組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較

注:與空白組比較：*P<0.05；與模型組比較：△P<0.05。圖4 Western Blotting檢測大鼠肝組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量

3.6 免疫熒光檢測大鼠肝組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

圖5示，綠色熒光為Bcl-2、Bax陽性細(xì)胞，廣泛表達(dá)于胞漿。結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組Bcl-2表達(dá)顯著增多，Bax表達(dá)量減少且熒光不顯著；與模型組比較，馬蘭草臍灸組Bcl-2表達(dá)顯著減少且熒光顯著減弱，Bax表達(dá)顯著增多，秋水仙堿組的Bcl-2、Bax表達(dá)量均顯著增多且熒光顯著增強(qiáng)。

圖5 免疫熒光檢測大鼠肝組織BCL-2、BAX蛋白表達(dá)比較(DAB×200)

3.7 Tunel-α-SMA熒光雙染檢測肝組織中活化的HSCs

圖6示，綠色熒光為α-SMA陽性細(xì)胞，紅色熒光為tunel陽性細(xì)胞，玫紅色熒光為Tunel-α-SMA熒光雙染陽性細(xì)胞并代表已凋亡的活化HSCs。結(jié)果顯示，空白組無Tunel陽性細(xì)胞，有少量且不顯著α-SMA陽性細(xì)胞；模型組有少量且不顯著的Tunel陽性細(xì)胞，有大量且顯著的α-SMA陽性細(xì)胞；與模型組比較，馬蘭草臍灸和秋水仙堿干預(yù)后的大鼠肝組織中α-SMA陽性細(xì)胞明顯減少，熒光明顯減弱，Tunel陽性細(xì)胞明顯增多。

圖6 Tunel-α-SMA熒光雙染檢測肝組織中活化的HSCs(DAB×200)

4 討論

HF是由不同病因(乙肝、丙肝、酒精、藥物等)所致的慢性創(chuàng)傷愈合反應(yīng)，并由多種細(xì)胞因子、ECM等相互作用形成。其中靜止的HSCs活化轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞(myofibroblasts, MFB)的過程是關(guān)鍵步驟[7]。目前主要抗HF的藥物是以抑制HSCs活化、誘導(dǎo)活化的HSCs凋亡，從而促進(jìn)基質(zhì)降解為治療靶向。中醫(yī)藥抗HF的研究備受關(guān)注，根據(jù)中藥多層次、多途徑、多靶點、多環(huán)節(jié)的作用特點，其分子機(jī)制的現(xiàn)代研究主要從抑制HSCs活化、誘導(dǎo)活化的HSCs凋亡、調(diào)節(jié)膠原代謝等幾個方面著手[8]。有數(shù)據(jù)證實，槲皮素通過線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)直接激活人類前列腺癌細(xì)胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)(cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase)誘導(dǎo)凋亡[9]。本實驗研究馬蘭草絨灸臍通過線粒體細(xì)胞凋亡途徑促使活化的HSCs凋亡，減少ECM沉積，使HF逆轉(zhuǎn)。

線粒體細(xì)胞凋亡途徑是以細(xì)胞色素C(cytochrome C,Cyt-C)的釋放為起始信號，通過Bcl-2家族蛋白的內(nèi)源性線粒體通路觸發(fā)Csapase級聯(lián)反應(yīng)的不可逆凋亡為特點[9]。Cyt-C是呼吸鏈的電子載體，與細(xì)胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase,COX)共價結(jié)合定位于線粒體內(nèi)膜，Cyt-C在呼吸鏈電子傳遞過程中作為COX的電子供體，促成COX還原氧分子為水，線粒體COX活性與線粒體功能成正相關(guān)[10-12]。本研究結(jié)果提示，馬蘭草灸臍可以抑制CCl4誘導(dǎo)的HF大鼠肝線粒體COX活性，減少ATP合成，促進(jìn)活化的HSCs凋亡。另外，Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax[13-14]，細(xì)胞存活與否二者表達(dá)量比例有關(guān)，Bcl-2通過穩(wěn)定線粒體膜功能，阻止線粒體釋放Caspase、Cyt-C以及凋亡因子等[15]；Bax拮抗Bcl-2，兩者表達(dá)呈反比，當(dāng)Bax大量表達(dá)時與Bcl-2蛋白形成異源二聚體加速細(xì)胞凋亡[16]。有研究顯示[17]，雙氫青蒿素可以增強(qiáng)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，同時削弱抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，導(dǎo)致Bax/Bcl-2比值升高，進(jìn)而觸發(fā)線粒體凋亡通路。本研究顯示，馬蘭草臍灸組的促凋亡Bax蛋白有顯著上升，抗凋亡Bcl-2蛋白表達(dá)下降，提示馬蘭草臍灸組能更好地促進(jìn)活化的HSCs凋亡，有效逆轉(zhuǎn)大鼠HF；同時免疫熒光結(jié)果與WB結(jié)果趨勢一致，馬蘭草臍灸可造成細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞融合、核碎裂等細(xì)胞凋亡趨勢。

正常肝臟的HSCs位于竇周間隙，形態(tài)不規(guī)則，其立體分布與延伸的胞突足以覆蓋整個肝竇微循環(huán)。α-SMA具有收縮性、原始炎癥性和高增殖性特點，靜止的HSCs合成膠原能力低，不表達(dá)α-SMA，而活化的HSCs則高表達(dá)α-SMA，因此，α-SMA表達(dá)已被用于識別肝組織是否含有MFB及HSCs是否處于活化狀態(tài)[18]。在HF病程高級階段，肝臟內(nèi)ECM約為正常量的6倍，其中膠原是ECM的主要成分。有研究證實[19]，在CCl4誘導(dǎo)的HF小鼠中，芬銳替尼可呈劑量依賴性地減少肝中膠原沉積，對HF有一定的逆轉(zhuǎn)作用。本研究結(jié)果顯示，模型組α-SMA陽性細(xì)胞表達(dá)顯著，提示動物造模成功，馬蘭草臍灸組的Tunel-α-SMA陽性細(xì)胞表達(dá)顯著增加，提示馬蘭草臍灸干預(yù)可有效促進(jìn)活化的HSCs凋亡，顯著逆轉(zhuǎn)HF。另外，以膠原為代表的肝臟ECM代謝失衡、生成大于降解是其生化學(xué)基礎(chǔ)[20]。Hyp是一種只存在于膠原中的氨基酸，是HF纖維膠原產(chǎn)生的主要來源，一定程度上反映纖維化肝組織中的膠原含量?；罨腍SCs高表達(dá)Hyp。有研究顯示，CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT enhancer binding protein-α, C/EBP-α)，可降低CCl4誘導(dǎo)的HF小鼠的膠原蛋白和Hyp含量[21]。本研究結(jié)果顯示，馬蘭草臍灸可以更好地抑制HF進(jìn)程，有效阻止肝細(xì)胞的結(jié)締組織形成。

HF根據(jù)其癥狀和體征屬于中醫(yī)學(xué)“黃疸”“脅痛”“積聚”“鼓脹”等范疇。據(jù)《臨證指南醫(yī)案》載：“病初始在氣,久必入血”和《張氏醫(yī)通·積聚》載：“正氣不足,而后邪氣踞之”，均認(rèn)為正虛濕毒瘀阻是HF的主要病機(jī)。中醫(yī)治療HF遵循扶正祛邪的原則，常用攻、消、散、補(bǔ)四大法則來治療[22]。中醫(yī)臍灸療法又稱“神闕灸”，神闕穴聯(lián)系全身經(jīng)脈，通過經(jīng)氣的運行輸布，內(nèi)至臟腑經(jīng)絡(luò)，外達(dá)四肢百骸，五官九竅乃至皮毛。西醫(yī)認(rèn)為臍在胚胎發(fā)育過程中為腹壁最后閉合處，無真皮層，滲透吸收力最強(qiáng)，諸多藥物均可通過臍快速進(jìn)入體內(nèi)而達(dá)全身[23]。前期研究中初步發(fā)現(xiàn)，馬蘭草臍灸能改善肝硬化腹水大鼠一般情況，引起腹水消退，并對肝線粒體具有一定影響。馬蘭草為菊科馬蘭的全草，其主要化學(xué)成分包括萜類、甾體、脂肪族、醌類、黃酮類等化合物，含有Cu、Se、Hg、Pb、Cd、As、Cr 等多種微量元素[24-25]。有研究顯示[26-27]，馬蘭草水煎液具有一定的預(yù)防和治療胃潰瘍的作用；另研究發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯部位(B)及水部位(D)可能為馬蘭抗實驗性胃潰瘍作用的主要藥效部位。本研究結(jié)果顯示，馬蘭草臍灸組大鼠肝臟表面呈深褐色較潤澤，ALT、AST水平明顯降低，同時可見脂肪細(xì)胞變性減少，提示馬蘭草臍灸可有效改善肝臟硬度，增加肝臟供血量，減緩肝細(xì)胞損傷程度。

綜上所述，馬蘭草臍灸以線粒體細(xì)胞凋亡通路為靶向誘導(dǎo)活化的HSCs凋亡，可能是其治療HF的機(jī)制之一。本文通過對其作用機(jī)制的研究，為馬蘭草臍灸治療HF提供了新的理論依據(jù)，并且為民族中醫(yī)藥的開發(fā)及臨床運用提供了實驗依據(jù)。