王 猛，馬 朋，靳雅倩，王同壯，張 軍，姚 玲，曹文富△，王建偉△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400016； 2.重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，重慶 400016；3.重慶市中醫(yī)藥防治代謝性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

2型糖尿病(T2DM)是一種影響全人類健康的慢性代謝性疾病，其特征是胰島素分泌受損或胰島素抵抗[1]。胰島素抵抗是指各種原因?qū)е缕咸烟菙z取和利用效率下降，機(jī)體代償性分泌過多胰島素產(chǎn)生高胰島素血癥的一種病理學(xué)狀態(tài)。胰島素抵抗易導(dǎo)致代謝綜合征和2型糖尿病，常常出現(xiàn)肝、肌肉和脂肪組織對(duì)胰島素刺激的不敏感[2]?？紤]到肝臟在糖脂代謝中發(fā)揮的關(guān)鍵作用，肝胰島素抵抗被稱為中央胰島素抵抗，是全身胰島素抵抗和代謝綜合征發(fā)生發(fā)展的重要誘導(dǎo)因素[3]。

生姜在2000多年前就被應(yīng)用于治療各種疾病，中醫(yī)認(rèn)為生姜性辛、微溫，歸肺、脾、胃經(jīng)，具有調(diào)理肺胃功能、促進(jìn)津液運(yùn)行輸布的作用?，F(xiàn)代研究證實(shí)，生姜能降低糖尿病患者胰島素、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平，改善胰島素敏感性[4]。6-姜烯酚是生姜中主要成分6-姜酚脫水形成的烷基酚類化合物，具有改善老年大鼠脂肪組織胰島素敏感性的作用[5]。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步觀察其對(duì)db/db糖尿病小鼠肝臟組織胰島素敏感性的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。本研究已通過重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)審查。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)db/db 小鼠 (BKS-Leprem2Cd479/Gpt)和BKS小鼠 (雌雄各半)，11周齡，購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK (蘇)2018-0008。

1.2 主要試劑與儀器

6-姜烯酚 (日本京都大學(xué) Pharma food 研究所饋贈(zèng)，純度≥98 %)；阿拉伯膠 (上海生物工程有限公司，批號(hào)MC0124B1013 J)；甘油三酯檢測試劑盒 (南京建成，批號(hào)2018040017)；血漿胰島素測定試劑盒(江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司，批號(hào)MM-0579M1)；葡萄糖測定試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，批號(hào)20171004147)；M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit (寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)RR047 A)；SYBR?Premix Ex Taq II 試劑 (寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)RR820 L)；異氟烷 (深圳市瑞沃德生命科技有限公司，批號(hào)217180801)；PGC1-α抗體 (稀釋比例1∶1000，上海艾博抗貿(mào)易有限公司，批號(hào)AB54481)；GLUT2抗體(稀釋比例1∶1000，美國Santa Cruz生物技術(shù)公司，批號(hào)SC9117)；GAPDH (美國ImmunoWay生物技術(shù)公司，批號(hào)YM3029)。

SynergyTMHTX 全自動(dòng)酶標(biāo)儀 (美國Bio Tek公司)；Mini-PROTEAN?Tetra System 垂直電泳裝置、濕轉(zhuǎn)印儀 (美國Bio-Rad公司)；Odyssey?Fc雙色紅外熒光成像系統(tǒng) (美國 LI-COR 公司)；CFX96 Touch RT-PCR儀 (美國Bio-Rad公司)；icEN-24R高速冷凍離心機(jī)(杭州奧盛儀器有限公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及處理

取db/db小鼠24只，飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度21±1 ℃，相對(duì)濕度55±5%，12 h/12 h 明暗交替，自由攝食飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為db/db 小鼠模型組 (db/db, n=8, 雌雄各半)、db/db小鼠6-姜烯酚低劑量組 (SL, 10 mg/kg, n=8, 雌雄各4只)、db/db小鼠6-姜烯酚高劑量組 (SH, 40 mg/kg, n=8, 雌雄各4只)，另取BKS小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后作為正常對(duì)照組 (BKS, n=8, 雌雄各4只)。正常對(duì)照組及疾病模型組每日按體質(zhì)量10 mL/kg給予5%阿拉伯膠灌胃，6-姜烯酚藥物組將藥溶于5 %阿拉伯膠中，按照10 mL·kg-1灌胃，每天給藥1次。各組均給予正常飲食、飲水，每2 d記錄進(jìn)食量，每3 d記錄體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)21天結(jié)束后處死取肝臟稱重，立即液氮凍存，后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存，用于蛋白和基因的檢測。

2.2 生化檢測

實(shí)驗(yàn)第2周末，所有小鼠禁食過夜12 h，麻醉后于眼眶后靜脈叢取血。然后給予40%濃度葡萄糖按10 ml/kg劑量灌胃處理，分別于20 min、60 min、120 min眼眶靜脈叢取血，4 ℃ 3000 r/pm，離心15 min，取血漿放入-20 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆茫褂迷噭┖袦y定禁食血漿葡萄糖、胰島素及各時(shí)間段血糖水平，具體操作嚴(yán)格按照相關(guān)說明書進(jìn)行。計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)和胰島素敏感性指數(shù)(HOMA-IS)。

計(jì)算公式: HOMA-IR指數(shù)=FBG(空腹血糖水平)(mmol/L)× FINS(空腹胰島素水平)(mIU/L)/22.5；HOMA-IS指數(shù)=1/HOMA-IR指數(shù)。

肝臟甘油三酯(TG)檢測：取肝臟組織適量(60 mg左右)，加入定量異丙醇(異丙醇=50 mg：1 mL)按照比例加入異丙醇勻漿，4 ℃振蕩過夜，次日3000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清測定TG含量，具體操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

2.3 RT-PCR檢測

Trizol法提取總 mRNA，參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行去基因組反轉(zhuǎn)錄，以 β-actin 為內(nèi)參進(jìn)行檢測(引物如表1所示)。

表1 RT-PCR 相關(guān)基因引物序列(5′到 3′)

2.4 Western blot 檢測

RIPA法提取肝臟總蛋白，BCA法檢測濃度，調(diào)濃度至3μg/μL，每樣本10 μL進(jìn)行PAGE-SDS凝膠電泳，依照分子量不同250 mA 恒流電轉(zhuǎn)相應(yīng)時(shí)間，5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，室溫孵育相應(yīng)二抗，TBST洗膜，ECL發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。Image J軟件統(tǒng)計(jì)條帶灰度值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 6-姜烯酚對(duì)db/db小鼠一般參數(shù)的影響

結(jié)果顯示，與BKS對(duì)照組比較，db/db模型組小鼠的攝食水平明顯增高(P<0.05)；與模型組比較，6-姜烯酚低、高劑量組飲食水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.89，P=0.66)。圖1示，6-姜烯酚未影響db/db小鼠的攝食量。與對(duì)照組比較，db/db小鼠的體質(zhì)量和肝重均明顯增加(P<0.05)，但6-姜烯酚用藥組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

注：BKS(正常對(duì)照組，n=8)；db/db(模型組，n=8)；SL(6-姜烯酚低劑量組，10 mg/kg，n=8)；SH(6-姜烯酚高劑量組，40 mg/kg，n=8)；與BKS組比較：*P<0.05圖1 6-姜烯酚對(duì)各組小鼠一般參數(shù)影響比較(A.進(jìn)食量；B.體質(zhì)量；C.肝重)

3.2 6-姜烯酚對(duì)db/db小鼠生化指標(biāo)的影響

圖2示，與BKS組比較，db/db模型組小鼠的禁食血漿葡萄糖、OGTT曲線下面積(AUC)均表現(xiàn)出明顯的增高趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與db/db模型組比較，6-姜烯酚低劑量組與高劑量組小鼠的血漿葡萄糖、OGTT曲線下面積(AUC)均表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，高劑量組小鼠下降趨勢(shì)更加明顯，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與BKS對(duì)照組比較，db/db模型組小鼠的禁食血漿胰島素、HOMA-IR、肝臟TG含量均明顯升高(P<0.05)，HOMA-IS指數(shù)明顯降低(P<0.05)；與db/db模型組比較，6-姜烯酚高劑量組小鼠的禁食血漿胰島素、HOMA-IR指數(shù)、肝臟TG含量顯著降低(P<0.05)，HOMA-IS指數(shù)升高(P<0.05)，但6-姜烯酚低劑量組小鼠未有明顯的改善效果(P>0.05)。

注：BKS(正常對(duì)照組，n=8)；db/db(模型組，n=8)；SL(6-姜烯酚低劑量組，10 mg/kg，n=8)；SH(6-姜烯酚高劑量組，40 mg/kg，n=8)；與BKS組比較：*P<0.05；與db/db模型組比較；#P<0.05(A.禁食血糖;B.OGTT試驗(yàn)結(jié)果;C.OGTT曲線下面積；D.禁食血漿胰島素；E.HOMA-IR指數(shù)；F.HOMA-IS指數(shù)；G.肝臟甘油三酯含量)圖2 6-姜烯酚對(duì) db/db小鼠生化指標(biāo)影響比較

3.3 6-姜烯酚對(duì) db/db小鼠肝臟糖異生相關(guān)基因表達(dá)的影響

由于6-姜烯酚高劑量用藥組作用效果明顯，所以只進(jìn)行了BKS對(duì)照組、db/db模型組與高劑量用藥組的肝臟胰島素抵抗相關(guān)基因與蛋白的檢測。圖3示，與BKS對(duì)照組比較，db/db模型組小鼠的G6PC、PEPCK表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與db/db模型組比較，6-姜烯酚高劑量組小鼠的G6PC、PEPCK表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

注： BKS(正常對(duì)照組，n=8)；db/db(模型組，n=8)；SH(6-姜烯酚高劑量組，40 mg/kg，n=8)；與BKS組比較：*P<0.05；與db/db模型組比較：#P<0.05(A.肝臟G6PC基因表達(dá)水平；B.肝臟PEPCK基因表達(dá)水平)圖3 6-姜烯酚對(duì)db/db小鼠肝臟糖異生相關(guān)基因影響比較

3.4 6-姜烯酚對(duì) db/db小鼠肝臟胰島素抵抗相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖4示，與BKS對(duì)照組比較，db/db小鼠模型組的PGC1-α、GLUT2表現(xiàn)出明顯表達(dá)量的下降(P<0.05)；與db/db小鼠模型組比較，6-姜烯酚高劑量組小鼠的PGC1-α、GLUT2的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。

注：BKS(正常對(duì)照組，n=8)；db/db(模型組，n=8)；SH(6-姜烯酚高劑量組，40 mg/kg，n=8)；與BKS組比較：*P<0.05；與db/db模型組比較：#P<0.05(A.Western Blotting結(jié)果；B.肝臟GLUT2蛋白表達(dá)水平；C.肝臟PGC1-α蛋白表達(dá)水平)圖4 6-姜烯酚對(duì)db/db小鼠肝臟胰島素抵抗相關(guān)蛋白影響比較

4 討論

胰島素抵抗屬于中醫(yī)學(xué)“脾癉”等范疇，仝小林教授總結(jié)脾癉病機(jī)與肥人素體脾虛所致水谷不化、痰濕蘊(yùn)與中焦密切相關(guān)[6]。生姜入肺、脾、胃經(jīng)，其辛散之力強(qiáng)可助肺、脾、胃輸布精微物質(zhì)至全身，使痰濕得化，中滿得消。如《雷公炮制藥性解》[7]所述：“生姜辛入肺，肺得所勝，則氣通宣暢……中焦之元?dú)舛?，而脾胃出納之令行?！碧鞘撬染⒌囊环N，而胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)常常表現(xiàn)為糖異生、轉(zhuǎn)運(yùn)及利用的障礙，即水谷精微的輸布、轉(zhuǎn)化失常。因此，生姜很可能通過調(diào)節(jié)精微物質(zhì)即糖的異生、轉(zhuǎn)運(yùn)及利用等諸多環(huán)節(jié)，從而改善胰島素的敏感性。基于此，本研究以糖尿病db/db小鼠為模型動(dòng)物，從對(duì)糖異生通路和GLUT2的影響來探討生姜的主要活性成分6-姜烯酚，改善胰島素抵抗的作用及機(jī)制。

胰島素抵抗體現(xiàn)了機(jī)體對(duì)胰島素敏感性的下降，所以常常伴隨著高血糖癥及高胰島素血癥。研究結(jié)果顯示，db/db糖尿病小鼠模型組的血漿葡萄糖、胰島素水平及HOMA-IR相比對(duì)照組明顯上升，HOMA-IS降低，表明其存在胰島素敏感性下降。高劑量的6-姜烯酚干預(yù)明顯降低了這些指標(biāo)參數(shù)，提示6-姜烯酚改善了db/db糖尿病小鼠的胰島素敏感性。

眾所周知，糖異生是生物體將多種非糖物質(zhì)轉(zhuǎn)變成葡萄糖或糖原的過程。在哺乳動(dòng)物中，肝是糖異生的主要器官。正常情況下，肝葡萄糖生成量約占內(nèi)源性葡萄糖生成量的90%，這對(duì)于全身性葡萄糖穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[8]。肝臟中胰高血糖素和胰島素信號(hào)通路的正?；顒?dòng)，對(duì)于控制肝葡萄糖的產(chǎn)生起著關(guān)鍵作用。胰高血糖素可以通過激活與FoxO1密切作用的PGC-1α，從而進(jìn)一步激活糖異生中的關(guān)鍵基因(磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK和葡萄糖-6-磷酸酶G6Pase)[9-13]，以促進(jìn)肝臟葡萄糖的形成。高血糖狀態(tài)則會(huì)激活胰島細(xì)胞產(chǎn)生胰島素，通過降低PEPCK和G6Pase的活性抑制糖異生途徑，從而調(diào)節(jié)血糖至正常水平。但胰島素信號(hào)通路的受損會(huì)導(dǎo)致糖異生調(diào)節(jié)途徑異常，從而病理性地出現(xiàn)糖異生關(guān)鍵基因(PEPCK和G6PC)的表達(dá)增高，血糖水平不受胰島素控制，表現(xiàn)出胰島素敏感性降低并產(chǎn)生胰島素抵抗。有研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者表現(xiàn)出PGC1-α活性的降低，這可能與線粒體功能障礙有關(guān)[14-15]。PGC1-α是線粒體生成的核心調(diào)控因子[16]，已有研究證明，其在大鼠骨骼肌中被激活可以預(yù)防線粒體功能障礙和胰島素抵抗[17]。本研究結(jié)果顯示，與BKS正常對(duì)照組比較，db/db糖尿病小鼠的PEPCK和G6PC蛋白表達(dá)量增高，同時(shí)存在PGC1-α活性的降低，結(jié)合其血漿葡萄糖、胰島素水平及HOMA-IR的上升，反映了db/db小鼠肝臟組織存在著糖異生調(diào)節(jié)途徑的受損及胰島素抵抗，與研究報(bào)道一致。經(jīng)過6-姜烯酚的處理，逆轉(zhuǎn)了db/db小鼠PEPCK和G6PC的高表達(dá)，增加了PGC1-α的活性，提示6-姜烯酚改善db/db糖尿病小鼠的胰島素敏感性可能與調(diào)節(jié)糖異生通路相關(guān)的PEPCK、G6PC和PGC1-α蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

目前認(rèn)為，胰島素信號(hào)途徑的受損是胰島素抵抗發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制，其中IRS1/IRS2/Akt/GLUT2是重要靶標(biāo)[18-20]。GLUT2作為葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體家族的一員，其肝臟組織的高表達(dá)能改善肝葡萄糖攝取和利用，從而改善高血糖狀態(tài)[21]。亦有研究證明，GLUT2表達(dá)的增高可以產(chǎn)生對(duì)胰島素抵抗的抑制作用[22]，并且改善了肝臟的脂質(zhì)沉積。本研究結(jié)果顯示，與BKS正常對(duì)照組比較，db/db糖尿病小鼠模型組肝臟甘油三酯含量表現(xiàn)出較明顯的升高，同時(shí)伴隨著GLUT2活性的降低，高劑量的6-姜烯酚明顯逆轉(zhuǎn)了這一趨勢(shì)，提示6-姜烯酚可能通過調(diào)節(jié)GLUT2通路促進(jìn)肝臟葡萄糖的攝取與利用，進(jìn)而改善胰島素敏感性。

綜上所述，6-姜烯酚能夠改善db/db糖尿病小鼠肝臟胰島素敏感性，可能與抑制糖異生通路、促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)與利用密切相關(guān)。