王靜芝，杜艷軍△，陳 麗，黃瀏嬌，瞿 濤，周煥嬌，陳 茜

(1.湖北中醫(yī)藥大學針灸骨傷學院/針灸治未病湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430061；2.湖北中醫(yī)藥大學中醫(yī)臨床學院，武漢 430061)

隨著人口老齡化日益嚴重, 老年期癡呆的發(fā)病率呈上升趨勢。輕度認知功能損害(mild cognitive impairment, MCI)是介于正常老化和癡呆之間的一種不穩(wěn)定的認知損傷狀態(tài)，每3～4年有20%～66%的MCI患者認知功能持續(xù)惡化，最終導致癡呆的發(fā)生，其中大部分為阿爾茨海默型癡呆(alzheimer disease，AD)，MCI是AD的重要危險因素[1-2]。胰島素對中樞神經系統(tǒng)的影響包括攝食行為、能量儲存、記憶認知功能[3]，中樞胰島素抵抗(insulin resistance, IR)可以引起輕度認知功能損害，輕、中度認知功能下降[4]。

Aβ是由淀粉樣前體蛋白(APP)經β-和γ-分泌酶的蛋白水解作用產生，Aβ的増加與沉積可通過生成具有神經毒性的老年斑誘發(fā)神經元變性與死亡。神經元微管相關蛋白(Tau蛋白)過度磷酸化則是認知功能損害的又一發(fā)病機制[5-6]。胰島素信號轉導通路PKB/Akt的生理底物糖原合成酶激酶-3(glucogen synthase kinase-3,GSK3)，具有GSK-3α和GSK-3β 2種形式的異構體，其活性與Aβ沉積、tau蛋白過度磷酸化密切相關[7]。

本研究在造模同時給予受試動物電針預防性治療，與造模成功后的電針治療組作為對照，旨在觀察電針預防性治療對胰島素抵抗大鼠認知功能的保護作用。并通過觀察各組大鼠下丘腦Aβ42、p-tau、GSK-3α與GSK-3β表達變化與差異，探討電針治療在防治胰島素抵抗大鼠輕度認知功能損害的效應機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用清潔級雄性Wistar大鼠70只，8周齡，體質量(180±20) g，購自湖北省實驗動物研究中心，實驗動物許可證號SCXK(鄂)2015-0018。飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學實驗動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境溫度18～25 ℃，濕度45%～55%。

1.2 主要試劑與儀器

高脂飼料 (上海斯萊克實驗動物有限責任公司)，Aβ42、p-Tau(美國abcam，b10148、ab109390)，Dako REAL EnVision Detection System(安捷倫(Dako)，K5007)。小鼠單抗β-actin(42KD)(武漢博士德生物工程有限公司，BM0627)，兔多抗GSK3α(51KD)、兔多抗GSK3β(48KD)(武漢三鷹生物技術有限公司，13419-1-AP、 22104-1-AP)，HRP標記羊抗小鼠二抗、HRP標記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司，BA1051、BA1054)，磷酸酶抑制劑、PMSF、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天，S1873、ST506、P0013B、P0010)，TEMED、Trise-Base(Amresco，Amresc00761、Exp2017/12), HCl(信陽市化學試劑廠，GB622-89), Tris-base(西格瑪奧的(上海)貿易有限公司，v900483)。

RM 2016輪轉式病理切片機(德國Leica公司)；JK-6生物組織攤烤片機(武漢俊杰電子有限公司)；SKG抗原修復用電陶爐；電泳儀(Bio-Rad)；轉膜儀(Bio-Rad)；凝膠掃描成像系統(tǒng)(Bio-Rad)；BX53型顯微鏡(奧林巴斯生物顯微鏡)，LP115pH計(德國Metter-Toledo GmbH公司)；酶標儀(Thermo，mμLISKANMK3)；HI650離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；華佗牌毫針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)。

1.3 分組與造模

適應性喂養(yǎng)3 d后按隨機數字表法分為正常組(normal, N)、模型組(model, M)、預防組(preventing electro-acupuncture, p-EA)、電針組(electro-acupuncture,EA)、預防+阻滯劑組(p-EA+blocker LY294002, p-EA+b)、電針+阻滯劑組(EA+blocker LY294002，EA+b)、腦脊液組(cerebrospinal fluid, CSF)各10只。正常組(N)給予標準飲食(3.8kcal/g，含70%碳水化合物，20%蛋白質，10%脂肪)，其余各組采用高脂飼料(5.4kcal/g，含38.5%碳水化合物，15%蛋白質，46.5%脂肪)。喂養(yǎng)8周后大鼠尾靜脈采血檢測FPG、FINS，IRI=[FPG (mmol/L)×FINS (mIU/L)]/22.5，模型大鼠IRI與正常大鼠比較明顯升高時(P<0.001)為造模成功[8]。

1.4 電針干預

1.4.1 EA組 大鼠于造模成功后，使用 0.30×25 mm不銹鋼毫針，參照李忠仁主編《實驗針灸學》[9], 以標本配穴電針方法選擇關元、足三里(后三里)、豐隆和百會進行毫針針刺。足三里和豐隆穴直刺5～10 mm，關元穴向劍突方向斜刺5～7 mm，百會向后方平刺5 mm。采用電針治療儀(HANS-100 A型)連續(xù)波、頻率(2 Hz)、強度(1 mA)、通電(10 min)，同側足三里穴和豐隆穴連接同一輸出的2個電極，刺激強度根據局部肌肉收縮情況決定。每日電針10 min，每周5次治療，總療程為8周。以上采取的刺激頻率和電針時間、療程綜合文獻報道決定[10]。

1.4.2 p-EA組 從造模開始進行電針治療，電針方法同EA組，持續(xù)16周。

1.4.3 p-EA+b組 大鼠稱重后以10%水合氯醛(30 mg/kg)腹腔麻醉。將大鼠固定于腦立體定位儀，頭頂局部常規(guī)備皮、消毒，依照立體定位圖譜進行定位，于前囟后0.8 mm在中位顱蓋骨處用牙科鉆鉆一直徑2 mm的孔[11-12],以不銹鋼導管插入(長18.0 mm，外徑0.64 mm，內徑0.39 mm)留置(如圖1)；用帶帽的不銹鋼制導絲插入導管內封閉導管。手術后預防感染，將大鼠置于空籠內待6～8 h可清醒。術后2 d起取LY294002 (10 μm, 10 μL；1 μL/min)緩慢注射，留針8～10 min，以防藥物沿針道返流顱外。電針治療同p-EA組，共計16周。

1.4.4 EA+b組 造模成功后，每日電針干預前1 h，大鼠稱重后進行腦室灌注LY294002。腦室灌注同p-EA+b組。電針治療同EA組，持續(xù)8周。

1.4.5 CSF組 大鼠稱重后腦室留管同EA+b組。腦脊液：Na+145.5 ml/L, K+2.8 mol/L, Ca2+2.3 mol/L, Mg2+2.2 mol, Cl-128.5 mol/L, HCO3-23.1 mol/L, H2Po4-l.lmol/L, 葡萄糖0.6lg/L, 滲透壓289.omosM/L, PH 值7.3配置完成等量灌注，操作方法同EA+b組。電針治療同EA組。

圖1 大鼠腦立體定位及置管示意圖

1.5 指標收集與檢測

1.5.1 ELISA法檢測 大鼠空腹FPG、FIN 實驗16th周治療結束后，各組大鼠禁食12 h以尾靜脈采血靜置，離心取上清。ELISA 法按試劑盒操作要求檢測各組大鼠空腹FPG、FIN并計算各組大鼠IRI。

1.5.2 免疫組化 各組大鼠禁食12 h頸椎脫臼法處死，冰上剝取下丘腦，右側下丘腦組織-80 ℃保存?zhèn)溆?。左側下丘腦組織用多聚甲醛(4%)固定后，酒精脫水并進行浸蠟及包埋。切片厚度4 μm，經脫蠟、抗原修復，滴加一抗(Aβ42 1∶100，p-tau1∶100)、二抗，鏡下觀察并完成鏡檢拍照。使用IPP6.0軟件對免疫組化照片進行光密度分析，每張切片選取3張400倍照片做光密度分析，area為面積，IOD為積分光密度，density(mean)為平均光密度。

1.5.3 Western blot檢測 從-80 ℃冰箱中取出下丘腦組織，加入400 μL裂解液(含PMSF)碾磨、裂解離心取上清，使蛋白變性。BSA標準品稀釋為1、0.8、0.6、0.4、0.2標準蛋白，采用DG-3022 A酶標儀測定OD568并計算蛋白濃度。蛋白樣品(40μg)和Marker加入上樣孔，電泳1.5 h。凝膠根據Marker切下目的條帶，PVDF膜甲醇浸泡后同濾紙浸泡于電轉緩沖液。PVDF膜浸泡于含5%脫脂奶粉TBST，室溫搖床封閉2 h；浸泡一抗(β-actin 1∶200，GSK3-α1∶500，GSK3-β1∶1000)，封閉液稀釋相應的HRP標記二抗(1∶50000)，采用BandScan分析膠片灰度值。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠FPG、FINS與IRI水平變化比較

表1示，治療結束與N組比較，其他各組大鼠FPG、FINS與IRI明顯升高(P<0.05或P<0.01)；與M組比較，p-EA組、EA組、p-EA+b組與CSF組大鼠FPG、FINS和IRI均有不同程度降低(P<0.05或P<0.01)；與EA組比較，p-EA組大鼠的FINS與IRI降低(P<0.05)，EA+b組FPG、FINS與IRI升高(P<0.05), p-EA+b組大鼠的FPG與IRI升高(P<0.05)；與EA+b組比較，p-EA與CSF組大鼠的FPG、FINS和IRI降低(P<0.05)，p-EA+b組大鼠的FINS與IRI升高(P<0.05)；與CSF組比較，p-EA+b組大鼠的FPG、FINS與IRI升高(P<0.05)。

表1 各組大鼠FPG、FINS、IRI水平比較

2.2 各組大鼠下丘腦Aβ42與p-Tau表達比較

圖2示，第16周電針治療結束時，黑色箭頭所示棕黃色或棕褐色細胞膜是各組大鼠下丘腦Aβ42、p-Tau的陽性表達。N組與p-EA組大鼠下丘腦見極少量棕黃色或棕褐色淡染的陽性細胞；EA組、p-EA+b組與CSF組大鼠下丘腦偶見棕黃色或棕褐色淡染的陽性細胞；M組、EA+b組棕黃色或棕褐色陽性表達聚集數量多，著色深。

圖2 各組大鼠下丘腦Aβ42與p-Tau免疫組織化學(×400)

表2示，M組、p-EA組、EA組、EA+b組、p-EA+b組、CSF組大鼠Aβ42、p-Tau的陽性表達明顯高于N組(P<0.05或P<0.01)； p-EA組、EA組大鼠Aβ42、p-Tau的陽性表達低于M組、EA+b組、CSF組(P<0.05或P<0.01)； EA組與p-EA組大鼠之間Aβ42、p-Tau的陽性表達差異無統(tǒng)計學意義；p-EA+b組與CSF組大鼠Aβ42陽性表達差異無統(tǒng)計學意義。

表2 各組大鼠下丘腦Aβ42、p-Tau平均光密度比值及下丘腦GSK-3α、GSK-3β蛋白表達比較

2.3 各組大鼠下丘腦GSK-3α和GSK-3β蛋白表達比較

表2圖3示，與N組比較，其他各組大鼠下丘腦GSK-3α、GSK-3β蛋白表達增加(P<0.05或P<0.01)；與M組比較，p-EA、EA組和p-EA+b組大鼠下丘腦GSK-3α、GSK-3β蛋白表達減少(P<0.05或P<0.01)，CSF組大鼠GSK-3α差異無統(tǒng)計學意義，GSK-3β蛋白表達減少(P<0.05)；與EA組比較，p-EA組大鼠下丘腦GSK-3α、GSK-3β蛋白表達減少(P<0.05)，EA+b組、p-EA+b組CSF組大鼠下丘腦GSK-3α、GSK-3β蛋白表達增加(P<0.05)；與EA+b組比較，p-EA組大鼠下丘腦GSK-3α(P<0.05)，p-EA+b組、CSF組大鼠下丘腦GSK-3β蛋白表達減少(P<0.05)；與CSF組比較，EA+b組和p-EA+b組大鼠下丘腦GSK-3α、GSK-3β蛋白表達減少(P<0.05)。

圖3 各組大鼠下丘腦GSK-3α和GSK-3β蛋白表達電泳圖

3 討論

胰島素與大腦的生物活性、神經結構和生理功能密切相關，對中樞神經系統(tǒng)認知功能有著重要影響，胰島素相關信號分子傳導異常是IR發(fā)生的關鍵[13]。IR時，由胰島素介導的神經能量代謝出現異常引起神經元糖代謝紊亂，從而導致神經元功能障礙及中樞神經系統(tǒng)疾病的發(fā)生[14]。

本研究依據中醫(yī)針灸“治未病”理論，以足三里、關元、豐隆與百會四穴配伍，旨在培補先天之本、后天氣血生化之源的同時，祛痰消脂、疏通腦絡。研究中預防組受試動物在造模的同時給予電針治療，以期通過電針干預激發(fā)受試動物機體內在的抗病能力，預防IR與IR相關的認知功能損害，強調電針早期干預的預防效應。

GSK3是PI3K/Akt信號通路的生理底物，通過負反饋調節(jié)該通路的效應蛋白對IR的發(fā)生發(fā)展有重要影響。GSK-3α和GSK-3β是GSK3兩種形式的異構體?；罨腉SK-3a可以激活APPγ分泌酶使得Aβ沉積增加[15-16]，GSK-3β會造成tau蛋白過度磷酸化并導致神經纖維纏結；此外，GSK-3β通過提高胰島素受體底物的絲/蘇氨酸磷酸化水平來抑制胰島素受體對胰島素受體底物的酪氨酸磷酸化，通過抑制胰島素信號傳導加重IR[17-18]。因此，GSK-3α與GSK-3β的活化是IR與認知功能損害共同的病理改變。

本研究中，M組、EA+b組和p-EA+b組大鼠下丘腦GSK-3α與GSK-3β蛋白表達增加，這與其下丘腦中Aβ42與p-Tau陽性表達聚集數量多、著色深的結果一致。同時，這3組受試動物外周血FPG、 FINS及IRI水平升高。電針治療后，p-EA組、EA組外周胰島素抵抗程度顯著降低，下丘腦Aβ42與p-Tau陽性表達減少，GSK-3α與GSK-3β蛋白表達降低，且p-EA組治療效果優(yōu)于EA組， p-EA組與EA組p-Tau陽性表達結果無明顯差異。在中樞微量注入PI3K抑制劑LY294002的條件下，電針防治效應被阻斷，EA+b組、p-EA+b組大鼠的FPG、 FINS與IRI升高，Aβ42與p-Tau陽性表達聚集數量多、著色深，且GSK-3α與GSK-3β蛋白表達增加，說明電針對IR大鼠認知功能損傷的防治效應或可通過PI3K/Akt信號通路實現。這與我們前期研究中發(fā)現，電針調節(jié)PI3K/Akt信號通路相關分子活性，從而促進改善IR大鼠學習記憶能力的實驗結果相一致。然而CSF組大鼠在經過電針治療后，下丘腦GSK-3α與GSK-3β蛋白表達增加的同時，Aβ42與p-Tau陽性表達聚集數量減少、著色淺，且外周血FPG、 FINS及IRI水平降低?？紤]PI3K/Akt信號通路不是參與針灸防治IR認知功能損害的唯一途徑，因此電針防治胰島素抵抗相關認知功能損傷的作用機制值得更進一步的研究。