李 鵬，夏春輝，馮 凱，李志強

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是常見的急性腹部疾病，可分為輕度急性胰腺炎、中度重癥急性胰腺炎和重癥急性胰腺炎(SAP)[1-2]。SAP病死率約為38.4%，常導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，進而引起早期多器官功能不全綜合征(MODS)[3-4]。由于胰腺壞死和膿毒癥均可發(fā)展為晚期MODS；因此抑制SIRS,在SAP早期治療中至關(guān)重要。中性粒細胞是炎癥過程中的重要效應(yīng)細胞，SIRS患者外周血中性粒細胞凋亡延遲，壽命延長并過度激活；可釋放大量炎性介質(zhì)損傷正常組織和細胞，繼而加重SIRS病情，最終導(dǎo)致SAP發(fā)展成為了MODS[5-6]。

細胞型Fas相關(guān)死亡域樣白細胞介素-1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白(c-FLIP)可通過競爭性結(jié)合受體相互作用蛋白1(RIP1)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(Caspase-8)阻斷信號傳導(dǎo)形成和Caspase-8的活化，從而阻斷Fas介導(dǎo)的凋亡信號傳導(dǎo)，起到抑制凋亡的作用[7-8]。c-FLIP主要包括兩種單體型，即長c-FLIP(c-FLIPL)和短c-FLIP(c-FLIPS)，二者均能抑制死亡受體介導(dǎo)的細胞凋亡，但它們具有不同的生物學(xué)功能[6]。最新研究發(fā)現(xiàn)，c-FLIP與RIP1、Caspase-8、Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(FADD)形成復(fù)合體，隨后可能產(chǎn)生三種不同的生物學(xué)效應(yīng)，高表達c-FLIPS通過抑制Caspase-8的表達，加速釋放RIP1后激活壞死性凋亡通路[9-10]。目前尚無關(guān)于c-FLIP與SAP發(fā)病機制關(guān)系的報道，因此本研究擬探討c-FLIP不同單體沉默對SAP大鼠血液中性粒細胞凋亡的影響，為SAP的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級SD雄性大鼠60只，8周齡，體質(zhì)量(230±10)g，購自山東大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)2019-0002，動物使用許可證號：SYXK(魯)2019-0013，動物質(zhì)量合格證號：HG5300176，動物飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22～25℃，濕度50%～60%。

1.2主要試劑及儀器 RPMI 1640培養(yǎng)液(德國默克公司，批號：QW12014)；熱滅活新生牛血清(新西蘭Gibco公司，批號：26010-092)；青霉素、鏈霉素(美國sigma公司，批號CX1264、WS2547)；磷酸鹽緩沖液(PBS)、RIPA裂解緩沖液、BCA蛋白定量試劑盒、增強的ECL化學(xué)發(fā)光試劑均購于上海碧云天公司(批號：JH12745、SD21458、C503021、SF10036)；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒、Trizol試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，批號：EK206S、EK106)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、聚偏二氟乙烯膜購自上海橋星貿(mào)易有限公司(批號：A4100、A6211)；SYBR Premix Ex TagTM Ⅱ熒光定量PCR試劑盒(日本Takara公司，批號：XS620147)；c-FLIPS、c-FLIPL、RIP1、Caspase-8、β-actin一抗、辣根過氧化物酶(HRP)耦聯(lián)的二抗均購自美國BD Biosciences公司(批號：B65487、B25416、B20126、B63544、B10018)。HF-240型全自動生化分析儀(泰安市康宇醫(yī)療器械有限公司)；CX23型顯微鏡(奧林巴斯公司)；FACSCalibur型流式細胞儀(美國BD Biosciences公司)；NanoDrop 8000型分光光度計(美國賽默飛世爾科技公司)；7300型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；ChemiDocXRS+型凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司)。

1.3siRNA制備 參照c-FLIP的RefSeq序列及siRNA的設(shè)計原理，設(shè)計格式為AA19NTT、長度為21 bp的siRNA。由美國Ambion公司分別設(shè)計3條靶向于c-FLIPL及c-FLIPS單體基因不同位點的siRNA序列，即為：c-FLIP siRNA-NC、c-FLIPS siRNA、c-FLIPL siRNA。

1.4動物造模、分組及給藥

1.4.1動物造模：選取50只大鼠給予3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉并固定，于劍突下約3 cm處腹壁正中分層剪開皮毛、腹肌，循胃、十二指腸球及降部，暴露胰腺區(qū)域，找到主胰管，以24 G靜脈套管針于主胰管對側(cè)腸蹙刺入腸腔，稍退出針芯，循乳頭將軟套管穿入主胰膽管約0.5 cm，動脈夾固定，另于主胰膽管上游近肝門處動脈夾鉗夾。3%?；悄懰徕c溶液30 mg/kg，以12 ml/h速度微量泵注入，注射后拔除套管針。為保證模型制作穩(wěn)定，將?；悄懰徕c溶液中加入美蘭溶液1滴，注射成功時可清晰顯示胰管走行，并且藍色溶液未漏入腸腔[11]。

1.4.2動物分組及給藥：本次造模大鼠共死亡7只，造模成功率為86.00%(43/50)，隨機處死3只大鼠，并將剩余40只大鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組、c-FLIP siRNA-NC組、c-FLIPS siRNA組、c-FLIPL siRNA組，每組10只。檢測4組大鼠血清淀粉酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、血肌酐水平，獲取胰腺病理組織以確定SAP造模是否成功。另取10只大鼠為假手術(shù)組，假手術(shù)組大鼠將3%?；悄懰徕c溶液替換為生理鹽水，其余手術(shù)步驟同造模大鼠一致。假手術(shù)組無大鼠死亡，成功率100.00%。c-FLIP siRNA-NC組、c-FLIPS siRNA組、c-FLIPL siRNA組大鼠一次性尾靜脈注射對應(yīng)siRNA溶液1 nmol/ml[前期預(yù)實驗得出c-FLIPS siRNA、c-FLIPL siRNA對SAP大鼠的半數(shù)有效量(ED50)為2 nmol/ml，以1/2 ED 50為本實驗作用劑量]，注射體積為10 ml/kg；假手術(shù)組、對照組尾靜脈注射等量生理鹽水，轉(zhuǎn)染后72 h進行后續(xù)的各項指標檢測。

1.5大鼠腹水量、血清淀粉酶測定及胰腺組織病理 3%戊巴比妥鈉腹腔注射(30 mg/kg)麻醉各組大鼠，開腹，記錄腹水量，獲取其胰腺組織和血液。3000×g離心分離血清后，采用全自動生化分析儀測定血清淀粉酶水平。并將胰腺組織固定于4%甲醛中，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，蘇木素-伊紅(HE)染色后，用顯微鏡觀察并拍照。

1.6大鼠中性粒細胞分離、培養(yǎng)及凋亡水平測定 取各組大鼠下腔靜脈血液3 ml肝素抗凝，注入含有30 g/L葡聚糖的離心管中，混勻，于37℃恒溫水浴箱中靜置45 min，進行紅細胞自然沉降；取上層液至另一離心管，3000×g離心10 min，去上清；將沉淀重懸于含3%小牛血清的PBS中，再輕輕地鋪在等體積的淋巴細胞分離液上，水平離心機2000×g離心20 min，去上清加入1 ml無菌冰水30 s，溶解紅細胞；立即加入20 g/L 氯化鈉溶液1 ml充分混勻，恢復(fù)等滲，2000×g離心10 min，去上清；將沉淀以RPMI 1640培養(yǎng)液2000×g離心10 min洗2次；以含10%熱滅活新生牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 U/ml的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮細胞，調(diào)整細胞濃度為5×106/ml，培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細胞并用冰PBS洗滌，然后將細胞重懸于PBS，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，黑暗中孵育10 min后，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡。凋亡率=凋亡細胞數(shù)/(凋亡細胞數(shù)+正常細胞數(shù))×100%。

1.7大鼠中性粒細胞中c-FLIPS、c-FLIPL、RIP1、Caspase-8 mRNA水平測定 使用Trizol試劑從大鼠中性粒細胞中分離總RNA，并保存在80℃環(huán)境下，使用分光光度計測量RNA濃度和純度，所有樣品的OD 260/280為1.8～2.0，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA合成cDNA。PCR反應(yīng)在實時熒光定量PCR儀中進行，引物由杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司合成。引物序列分別為c-FLIPS：正向5'-CCCTGGTCAAATTGCTTAACCT-3'，反向5'-TTATTCGTCCCTCTGTTTTATG-3'；c-FLIPL：正向5'-CAGTGTGACTAAATTGTTGTGACTGTGA-3'，反向5'-CTGTGACTGATGGTCCCTCTGTCTGTGT-3'；RIP1：正向5'-CTCGTGCTGACTGTGCTGATCGTATTGTCGTCGATG-CTAGCAA-3'，反向5'-CGGGTCGTGCGGCTAGTGGTCCCTCTGCCGTGTAAATGCTTG-3'；Caspase-8：正向5'-CTCATCGTAGTGCTAGCTAGTCTCCCGTAGTAC-3'，反向5'-CCGTAGTAGTCGATCCCTCTGTTCGCGCGTAGC-3；GAPDH：正向5'-CCACATCGCTCAGACACCAT-3'，反向5'-ACCAGGCGCCCAATACGTGA-3'。將循環(huán)程序設(shè)定為在95℃初始保持10 min，然后在95℃變性，持續(xù)15 s，共40個循環(huán)，在50℃退火和延伸30 s，在72℃延伸15 s。使用2-ΔΔCt方法分析c-FLIPS、c-FLIPL、RIP1、Caspase-8 mRNA的相對表達，標準化為GAPDH。

1.8大鼠中性粒細胞中c-FLIPS、c-FLIPL、RIP1、Caspase-8 蛋白水平測定 在RIPA裂解緩沖液中裂解中性粒細胞，并在4℃下以3000×g離心10 min，提取蛋白質(zhì)上清液，BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。使用聚丙烯酰胺凝膠電泳將總蛋白分級分離并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，將膜在含有TBST緩沖液的3%新生牛血清白蛋白中封閉1 h，然后在4℃下與c-FLIPS、c-FLIPL、RIP1、Caspase-8、β-actin一抗(稀釋比均為1∶1000)孵育過夜，然后加入HRP耦聯(lián)的二抗(1∶5000稀釋)在室溫下孵育2 h，使用增強的ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測生成的蛋白質(zhì)，并將其暴露在暗室中。使用ChemiDocXRS+系統(tǒng)掃描條帶，蛋白質(zhì)水平的定量分析被標準化為β-actin水平。

2 結(jié)果

2.1大鼠腹水量、血清淀粉酶水平比較 與假手術(shù)組比較，對照組、c-FLIP siRNA-NC組腹水量、血清淀粉酶水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但對照組與c-FLIP siRNA-NC組腹水量、血清淀粉酶水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組和c-FLIP siRNA-NC組比較，c-FLIPS siRNA組、c-FLIPL siRNA組腹水量、血清淀粉酶水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但c-FLIPS siRNA組與c-FLIPL siRNA組腹水量、血清淀粉酶水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 5組大鼠腹水量、血清淀粉酶水平比較

2.2大鼠胰腺組織病理比較 假手術(shù)組胰腺組織結(jié)構(gòu)正常；對照組、c-FLIP siRNA-NC組胰腺組織壞死嚴重、崩解，胰腺細胞排列紊亂，可見大量炎性細胞浸潤；c-FLIPS siRNA組、c-FLIPL siRNA組壞死胰腺細胞減少，炎性細胞浸潤減少，但胰腺組織疏松紊亂。見圖1。

圖1 5組大鼠胰腺組織病理圖(HE×400)

2.3大鼠中性粒細胞凋亡率比較 5組大鼠的中性粒細胞凋亡率分別為假手術(shù)組(12.36±0.65)%、對照組(6.63±0.52)%、c-FLIP siRNA-NC組(6.78±0.45)%、c-FLIPS siRNA組(10.21±0.36)%、c-FLIPL siRNA組(10.45±0.45)%。與假手術(shù)組比較，對照組和c-FLIP siRNA-NC組中性粒細胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但對照組與c-FLIP siRNA-NC組中性粒細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組和c-FLIP siRNA-NC組比較，c-FLIPS siRNA組、c-FLIPL siRNA組中性粒細胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但c-FLIPS siRNA組與c-FLIPL siRNA組中性粒細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4大鼠中性粒細胞c-FLIPS、c-FLIPL、RIP1、Caspase-8 mRNA表達水平比較 與假手術(shù)組比較，對照組和c-FLIP siRNA-NC組中性粒細胞c-FLIPS、c-FLIPL mRNA表達水平升高，RIP1、Caspase-8 mRNA表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但對照組與c-FLIP siRNA-NC組上述指標比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組和c-FLIP siRNA-NC組比較，c-FLIPS siRNA組、c-FLIPL siRNA組中性粒細胞c-FLIPS、c-FLIPL mRNA表達水平降低，RIP1、Caspase-8 mRNA表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但c-FLIPS siRNA組與c-FLIPL siRNA組上述指標比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 5組大鼠中性粒細胞c-FLIPS、c-FLIPL、RIP1、Caspase-8 mRNA表達水平比較

2.5大鼠中性粒細胞c-FLIPS、c-FLIPL、RIP1、Caspase-8蛋白表達水平比較 與假手術(shù)組比較，對照組和c-FLIP siRNA-NC組中性粒細胞c-FLIPS、c-FLIPL蛋白表達水平升高，RIP1、Caspase-8蛋白表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但對照組與c-FLIP siRNA-NC組上述指標比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組和c-FLIP siRNA-NC組比較，c-FLIPS siRNA組和c-FLIPL siRNA組中性粒細胞c-FLIPS、c-FLIPL蛋白表達水平降低，RIP1、Caspase-8蛋白表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但c-FLIPS siRNA組與c-FLIPL siRNA組上述指標比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3、圖2。

圖2 5組大鼠中性粒細胞c-FLIPS、c-FLIPL、RIP1、Caspase-8蛋白免疫印跡圖

表3 5組大鼠中性粒細胞c-FLIPS、c-FLIPL、RIP1、Caspase-8蛋白表達水平比較

3 討論

機體內(nèi)中性粒細胞凋亡為壞死性凋亡，是細胞壞死的一種可調(diào)控類型，在實驗性AP的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。本研究結(jié)果顯示，與對照組和c-FLIP siRNA-NC組比較，c-FLIPS siRNA組、c-FLIPL siRNA組腹水量、血清淀粉酶降低，中性粒細胞凋亡率升高；這提示沉默c-FLIP的兩種單體c-FLIPS、c-FLIPL可明顯促進SAP大鼠血液中性粒細胞凋亡，進而對大鼠SAP具有明顯緩解作用。文獻報道，相同劑量的雨蛙素誘導(dǎo)大鼠AP模型，為急性水腫型胰腺炎，腺泡細胞以凋亡為主；并發(fā)現(xiàn)大鼠AP模型中存在c-FLIP的明顯激活，進一步用c-FLIP抑制劑作用于AP大鼠,發(fā)現(xiàn)腺泡細胞凋亡較少，臨床癥狀減輕，提示c-FLIP抑制劑對雨蛙素誘導(dǎo)的大鼠AP模型起到明顯的保護作用[12]。雨蛙素誘導(dǎo)的c-FLIP基因敲除大鼠AP模型中腺泡細胞壞死明顯減少，大劑量的膽囊收縮素可導(dǎo)致大鼠發(fā)生水腫型胰腺炎，并從中觀察到c-FLIP的激活，當(dāng)特異性抑制c-FLIP時，大鼠胰腺中壞死的腺泡細胞明顯減少，AP炎癥反應(yīng)減輕；提示壞死性凋亡c-FLIP激活可能是SAP加重的重要原因[13]。本研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組胰腺組織結(jié)構(gòu)正常；對照組和c-FLIP siRNA-NC組胰腺組織壞死嚴重、崩解，胰腺細胞排列紊亂，可見大量炎性細胞浸潤；c-FLIPS siRNA組和c-FLIPL siRNA組壞死胰腺細胞減少，炎性細胞浸潤減少，但胰腺組織疏松紊亂。也說明沉默c-FLIP的兩種單體c-FLIPS、c-FLIPL對大鼠的SAP具有保護作用。

壞死性凋亡是一種腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導(dǎo)的RIP1調(diào)控的非Caspase依賴性細胞凋亡方式[14-15]。TNF-α與其受體腫瘤壞死因子受體-1結(jié)合后，誘導(dǎo)復(fù)合物I合成[16-17]；該復(fù)合物可抑制RIP1去泛素化，從而導(dǎo)致胞漿內(nèi)FADD、RIP1和Caspase-8形成復(fù)合物；Caspase-8的存在阻止了RIP1與受體相互作用蛋白3結(jié)合，此時復(fù)合物誘導(dǎo)細胞發(fā)生經(jīng)典形式的凋亡[18]。

在Caspase-8被抑制或不能有效激活時，有活性的RIP1與RIP3結(jié)合形成復(fù)合物，將導(dǎo)致細胞發(fā)生壞死性凋亡[19]。c-FLIP在結(jié)構(gòu)上與Caspase-8相似，但無Caspase-8所具有的蛋白水解酶活性；傳統(tǒng)認為c-FLIP通過競爭性結(jié)合FADD和Caspase-8阻斷信號傳導(dǎo)形成和Caspase-8的活化，從而阻斷Fas介導(dǎo)的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，起到抑制凋亡的作用[20]。最新研究發(fā)現(xiàn)，高表達c-FLIPS通過抑制Caspase-8的表達，加速釋放RIP1后激活壞死性凋亡通路；高表達c-FLIPL可促進降解RIP1，四聚體解聚、凋亡與壞死性凋亡通路均被阻斷，細胞維持生存狀態(tài)[21]。c-FLIP低表達時，Caspase-8被激活，誘導(dǎo)細胞發(fā)生經(jīng)典細胞凋亡[22]。目前為止,不同單體型c-FLIP對Caspase-8的調(diào)控機制還不完全清楚；但c-FLIP不同單體型對細胞凋亡、壞死等不同細胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)化起重要作用。c-FLIP可能通過不同單體型對Caspase-8進行多重調(diào)控，在細胞經(jīng)典凋亡與壞死性凋亡間的相互轉(zhuǎn)化發(fā)揮重要作用[23]。本研究結(jié)果顯示，與對照組和c-FLIP siRNA-NC組比較，c-FLIPS siRNA組、c-FLIPL siRNA組大鼠中性粒細胞c-FLIPS、c-FLIPL mRNA和蛋白表達水平降低，RIP1 mRNA和蛋白、Caspase-8 mRNA和蛋白表達水平升高。說明了沉默c-FLIP的兩種單體c-FLIPS、c-FLIPL能明顯抑制SAP大鼠血液中性粒細胞c-FLIPS、c-FLIPL mRNA和蛋白水平的表達，促進RIP1、Caspase-8 mRNA和蛋白水平的表達，進而激活壞死性凋亡途徑，這也與上述討論一致。

綜上所述，沉默c-FLIP的兩種單體c-FLIPS、c-FLIPL可明顯促進SAP大鼠血液中性粒細胞凋亡并對SAP具有明顯緩解作用；其機制與沉默c-FLIP的兩種單體c-FLIPS、c-FLIPL能明顯抑制SAP大鼠血液中性粒細胞c-FLIPS mRNA和蛋白、c-FLIPL mRNA和蛋白水平的表達，促進RIP1 mRNA和蛋白、Caspase-8 mRNA和蛋白水平的表達，進而激活壞死性凋亡途徑有關(guān)。