劉早陽，任福強(qiáng)

肺炎是肺炎鏈球菌感染所致的呼吸系統(tǒng)主要疾病之一，已嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。肺泡上皮細(xì)胞具有屏障保護(hù)功能，其凋亡是引發(fā)肺炎的重要原因之一；因而如何減輕肺泡上皮細(xì)胞損傷已成為治療肺炎的關(guān)鍵。既往研究報道，部分中藥可減輕肺炎鏈球菌感染引起的肺泡上皮細(xì)胞損傷[1-3]。天麻素是我國中藥蘭科天麻屬植物天麻塊莖的主要提取物，其可抑制氧化應(yīng)激從而減輕小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷[4]；表明天麻素可通過抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等減輕細(xì)胞損傷，但其對肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷尚未可知。miR-223-3p在肺炎患者中呈高表達(dá)，并可能作為診斷肺炎的生物標(biāo)志物，但miR-223-3p在肺炎發(fā)生過程中的作用機(jī)制尚未闡明[5]。miR-223-3p在肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制，及其是否可作為天麻素減輕肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷的作用靶點尚未可知。本研究采用肺炎鏈球菌誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞建立細(xì)胞損傷模型，探討了天麻素是否可通過調(diào)控miR-223-3p的表達(dá)而影響肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 天麻素購自昆明制藥；肺炎鏈球菌購自美國ATCC；肺泡上皮細(xì)胞A549購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；白細(xì)胞介素-10(IL-10)、IL-6檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR購自美國Theromo Fisher公司；Lipofectamine2000、MTT試劑(北京索萊寶公)司；凋亡檢測試劑盒(美國Sigma)；兔抗人B細(xì)胞淋巴瘤/白血病相關(guān)X蛋白(Bax)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)抗體(美國Santa Cruz)；二抗(美國Abcam)；miR-223-3p寡核苷酸抑制物(miR-223-3p inhibitor)及陰性對照序列(anti-miR-NC)、miR-223-3p寡核苷酸模擬物(miR-223-3p mimic)及陰性對照mimic NC序列(miR-NC)均購自上海吉瑪。

1.2方法

1.2.1實驗分組：肺泡上皮細(xì)胞A549放入37℃水浴鍋中融化1 min后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液3 ml重懸；將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長密度達(dá)到90%時，使用0.25%胰蛋白酶消化，按照1∶2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期A549細(xì)胞4×105個/ml接種于96孔板，每孔100 μl，加入肺炎鏈球菌(1×108CFU/ml )培養(yǎng)細(xì)胞24 h[6]記為模型組。同時將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照組。分別加入不同濃度的天麻素(2.5、5.0、10.0 μmol/L)與肺炎鏈球(1×108CFU/ml )培養(yǎng)細(xì)胞24 h[7]，分別標(biāo)記為天麻素2.5 μmol/L組、天麻素5.0 μmol/L組、天麻素10.0 μmol/L組。使用不含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液與anti-miR-NC、miR-223-3p inhibitor混合后室溫孵育5 min(A液)，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑與不含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液充分混合(B液)；A液與B液充分混勻后室溫孵育20 min，并將其加入A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h棄上清液后更換正常培養(yǎng)液，并繼續(xù)培養(yǎng)48 h，隨后加入肺炎鏈球菌(1×108CFU/ml )培養(yǎng)細(xì)胞24 h，分別標(biāo)記為anti-miR-NC組、miR-223-3p inhibitor組。采用上述轉(zhuǎn)染方法將miR-NC、miR-223-3p mimic轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞后加入含10.0 μmol/L天麻素與肺炎鏈球菌(1×108CFU/ml )培養(yǎng)細(xì)胞24 h，分別標(biāo)記為天麻素10.0 μmol/L+miR-NC組、天麻素10.0 μmol/L+miR-223-3p mimic組。

1.2.2細(xì)胞增殖檢測：取各組A549細(xì)胞(4×105個/ml)接種于96孔板，每孔100 μl，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入DMSO 150 μl，室溫避光孵育5 min后應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測吸光度值(OD值)。

1.2.3細(xì)胞凋亡率檢測：各組A549細(xì)胞加入預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后棄上清，加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，分別加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl PI，室溫避光孵育10 min后，于1 h內(nèi)應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.4細(xì)胞中miR-223-3p的表達(dá)檢測：以Trizol法提取各組A549細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；按照qRT-PCR試劑盒配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)40次。以羅氏LightCycler480熒光定量PCR儀檢測miR-223-3p相對表達(dá)水平。

1.2.5IL-10、IL-6檢測水平：取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA法檢測IL-10、IL-6的水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.6Western blot檢測Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)：采用蛋白提取試劑盒提取各組A549細(xì)胞總蛋白，取50 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳反應(yīng)，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗稀釋液(1∶1000)后孵育過夜(4℃)，使用TBST洗滌后加入二抗稀釋液(1∶2000)，室溫孵育1 h后滴加ECL，暗室內(nèi)曝光顯影后應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞增殖、凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較 與對照組比較，模型組OD值、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，凋亡率、Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，天麻素5.0、10.0 μmol/L組OD值、Bcl-2蛋白水平升高，凋亡率和Bax蛋白水平顯著降低，且天麻素10.0 μmol/L組較天麻素5.0 μmol/L組上述指標(biāo)變化更顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；但天麻素2.5 μmol/L組與模型組OD值、凋亡率、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、2和表1。

表1 5組A549細(xì)胞活性、凋亡率及Bax、Bcl-2表達(dá)水平比較

圖1 流式細(xì)胞儀檢測5組A549細(xì)胞凋亡情況

圖2 5組A549細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)免疫印跡圖

2.2肺泡上皮A549細(xì)胞中miR-223-3p表達(dá)及炎性因子水平比較 與對照組比較，模型組IL-6水平和miR-223-3p的表達(dá)水平顯著升高，IL-10顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，天麻素5.0、10.0 μmol/L組IL-6、miR-223-3p的表達(dá)水平降低，IL-10升高；且天麻素10.0 μmol/L組較天麻素5.0 μmol/L組上述指標(biāo)變化更顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。但天麻素2.5 μmol/L組與模型組IL-6、IL-10及miR-223-3p表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.01)。見表2。

表2 5組A549細(xì)胞中miR-223-3p表達(dá)及炎性因子水平比較

2.3抑制miR-223-3p對肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549細(xì)胞活性及凋亡的影響 與anti-miR-NC組和模型組比較，miR-223-3p inhibitor組OD值和Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高，細(xì)胞凋亡率及Bax蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。模型組與anti-miR-NC組OD值、細(xì)胞凋亡率和Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3、4和表3。

表3 3組肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549細(xì)胞活性、凋亡率及Bax、Bcl-2表達(dá)水平比較

圖3 流式細(xì)胞儀檢測抑制miR-223-3p對肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡的影響

圖4 抑制miR-223-3p對肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡蛋白免疫印跡圖

2.4抑制miR-223-3p對肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549細(xì)胞中炎性因子的影響 與anti-miR-NC組和模型組比較，miR-223-3p inhibitor組IL-10水平升高，IL-6水平降低(P<0.01)。見表4。

表4 3組肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549細(xì)胞中炎性因子水平比較

2.5過表達(dá)miR-223-3p對天麻素處理肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549細(xì)胞活性及凋亡影響 與天麻素10.0 μmol/L+miR-NC組進(jìn)行比較，天麻素10.0 μmol/L+miR-223-3p mimic組OD值和Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖5、6和表5。

表5 過表達(dá)miR-223-3p對天麻素處理的肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549細(xì)胞活性、凋亡率及Bax、Bcl-2表達(dá)水平比較

圖5 流式細(xì)胞儀檢測過表達(dá)miR-223-3p對天麻素處理的肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡的影響

2.6過表達(dá)miR-223-3p對天麻素處理的肺炎鏈球菌誘導(dǎo)A549細(xì)胞炎性因子的影響 與天麻素10.0 μmol/L+miR-NC組比較，天麻素10.0 μmol/L+miR-223-3p mimic組IL-10水平降低，IL-6水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表6。

表6 過表達(dá)miR-223-3p對天麻素處理的肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549中炎性因子水平比較

3 討論

肺炎是臨床常見的一種呼吸系統(tǒng)疾病，其發(fā)病率逐漸增高，肺炎的主要病原菌是肺炎鏈球菌[8]。肺炎鏈球菌感染后，肺泡上皮細(xì)胞凋亡率升高，從而使患者機(jī)體的抗感染能力降低[9]。絨毛大黃菌葉提取物、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、皮質(zhì)紫荊顆粒等均可減輕肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷[10]。天麻素對肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷的影響尚未闡明。

圖6 過表達(dá)miR-223-3p對天麻素處理的肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡蛋白免疫印跡圖

天麻素可減輕海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷，并可降低缺氧缺糖誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化損傷及抑制細(xì)胞凋亡[11-12]。天麻素具有抗炎、抗氧化及抗凋亡等作用，并可改善糖氧剝奪誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷[13]。本研究結(jié)果顯示，肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞活力降低，凋亡率明顯升高，提示成功建立肺泡上皮細(xì)胞損傷模型。Bcl-2/Bax比值升高可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而比值降低可抑制細(xì)胞凋亡[14]。本研究結(jié)果顯示，模型組Bax表達(dá)水平升高，Bcl-2表達(dá)水平降低。提示天麻素可促進(jìn)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞的活力和增殖，并抑制細(xì)胞凋亡。IL-10屬于炎性抑制因子，高水平的IL-10可減輕肺損傷；IL-6屬于促炎因子，其水平升高可促進(jìn)肺損傷[15]。本研究結(jié)果顯示，模型組IL-10水平降低，IL-6水平升高，而天麻素5.0、10.0 μmol/L組可明顯使IL-6水平降低，IL-10水平提高，提示天麻素可以抑制肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)從而減輕炎性肺損傷。

miR-223-3p可通過調(diào)控炎性因子IL-6、IL-10、TNF-α及TLR4/TLR2/NF-κB/STAT3信號通路而參與脂多糖誘導(dǎo)人脂肪干細(xì)胞的損傷過程[16]。miR-223-3p負(fù)調(diào)控NLRP3炎性小體參與肝損傷過程[17]。本研究結(jié)果顯示，模型組miR-223-3p表達(dá)水平升高，天麻素5.0、10.0 μmol/L組miR-223-3p表達(dá)水平降低。提示天麻素可通過下調(diào)miR-223-3p的表達(dá)發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，抑制miR-223-3p表達(dá)可提高肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞活力，降低細(xì)胞凋亡率；并可使IL-10升高，IL-6降低。提示抑制miR-223-3p表達(dá)可促進(jìn)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，miR-223-3p過表達(dá)可降低天麻素對肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡，減輕炎癥反應(yīng)。

綜上所述，天麻素可通過下調(diào)miR-223-3p的表達(dá)而促進(jìn)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)，從而減輕肺泡上皮細(xì)胞損傷。miR-223-3p可能作為天麻素治療肺炎的潛在靶點，但關(guān)于其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探究。