韋登文，覃 年，廖艷英

心肌缺血再灌注損傷是引起心肌梗死、冠心病等心血管疾病的重要原因之一，因而減輕心肌缺血再灌注損傷成為研究重點(diǎn)[1-2]。部分研究顯示，麻醉藥物能夠減輕心肌缺血再灌注損傷，但其作用機(jī)制尚未闡明[3-4]。瑞芬太尼屬于芬太尼類μ型阿片受體激動(dòng)劑，其可抑制炎癥反應(yīng)及心肌細(xì)胞凋亡，從而減緩糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[5]。miR-574-3p在心血管疾病中表達(dá)異常，并可能參與心血管疾病的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程[6]。但miR-574-3p是否可作為瑞芬太尼減輕心肌缺血再灌注損傷的作用靶點(diǎn)，目前研究報(bào)道尚少。因此，本研究用缺氧/復(fù)氧處理心肌細(xì)胞，并建立心肌缺血再灌注損傷模型，探討了瑞芬太尼對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活性及凋亡的影響及其對(duì)miR-574-3p的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與試劑 注射用鹽酸瑞芬太尼(宜昌人福藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20030197)；大鼠心肌細(xì)胞H9C2(上海通派生物科技有限公司)；DMEM(美國(guó)Gibco)；胎牛血清、Lipofectamine2000(美國(guó)Thermo Fisher)；Trizol(美國(guó)Invitrogen)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒(北京天根有限公司)；anti-miR-con、anti-miR-574-3p、miR-con、miR-574-3p mimics(廣州銳博生物技術(shù)有限公司)；MTT、凋亡檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；兔抗鼠人CyclinD1、Cleaved-caspase-3與二抗(美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組：將H9C2細(xì)胞接種于24孔板(1×104個(gè)/孔)后，置于含有體積分?jǐn)?shù)為95%氮與5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱內(nèi)缺氧處理24 h；棄舊培養(yǎng)基后加入DMEM新鮮培養(yǎng)基，將其置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱復(fù)氧處理6 h[7]，建立心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型并記為模型組。將未經(jīng)處理的H9C2細(xì)胞記為對(duì)照組。H9C2細(xì)胞分別加入含有不同濃度(10、30、60 ng/ml)瑞芬太尼的培養(yǎng)基處理24 h[8]，然后進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理，分別記為低劑量組、中劑量組、高劑量組。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將anti-miR-con、anti-miR-574-3p轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞24 h后再進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理，分別記為anti-miR-con組、anti-miR-574-3p組。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將miR-con、miR-574-3p mimics轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞后加入含有60 ng/ml瑞芬太尼的培養(yǎng)基處理24 h，然后再進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理，分別記為高劑量miR-con組、高劑量miR-574-3p組。

1.2.2MTT檢測(cè)細(xì)胞活性：收集各組H9C2細(xì)胞接種于96孔板(4×103個(gè)/孔)，每孔加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl；培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心后棄上清，每孔加入150 μl DMSO，室溫避光振蕩孵育5 min，以酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度值(A490 nm)。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：取“1.2.1”處理后的H9C2細(xì)胞用500 μl結(jié)合緩沖液重懸，按照凋亡試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.4MDA、SOD含量檢測(cè)：取“1.2.1”處理后的H9C2細(xì)胞，用反復(fù)凍融法裂解細(xì)胞，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)MDA、SOD含量。

1.2.5qRT-PCR檢測(cè)miR-574-3p的表達(dá)水平：用Trizol法提取處理后的H9C2細(xì)胞總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書配置反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：42℃ 15 min，95℃ 3 min。RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系按照SYBR Green試劑盒說(shuō)明書操作，用ABI StepOnePlus熒光定量PCR儀檢測(cè)miR-574-3p的表達(dá)量。

1.2.6Western blot檢測(cè)CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)：取“1.2.1”處理后的H9C2細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，蛋白變性后進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至PVDF膜后室溫封閉2 h，4℃孵育CyclinD1(1∶1000)、Cleaved-caspase-3(1∶1000)、GAPDH(1∶3000)一抗過(guò)夜，室溫孵育二抗稀釋液(1∶5000)1 h，ECL顯影，用Image J軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1心肌H9C2細(xì)胞活性和凋亡率比較 與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞活性和CyclinD1蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，低、中、高劑量組細(xì)胞活性和CyclinD1蛋白表達(dá)水平升高，細(xì)胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平降低，且隨劑量的增加變化更顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表1。

表1 5組心肌H9C2細(xì)胞活性和凋亡率比較

圖1 不同濃度瑞芬太尼對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌H9C2細(xì)胞活性和凋亡的影響

2.2心肌H9C2細(xì)胞中MDA、SOD含量比較 與對(duì)照組比較，模型組MDA含量升高，SOD含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，低、中、高劑量組MDA含量降低，SOD含量升高，且隨劑量增加變化更顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 5組心肌H9C2細(xì)胞MDA、SOD含量比較

2.3心肌H9C2細(xì)胞中miR-574-3p表達(dá)水平比較 5組心肌H9C2細(xì)胞中miR-574-3p表達(dá)水平分別為對(duì)照組1.00±0.08、模型組3.19±0.21、低劑量組2.76±0.12、中劑量組1.83±0.12、高劑量組1.33±0.10。與對(duì)照組比較，模型組miR-574-3p表達(dá)水平升高(P<0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組miR-574-3p表達(dá)水平降低，且隨劑量增加表達(dá)水平進(jìn)一步降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4轉(zhuǎn)染anti-miR-con、anti-miR-574-3p后心肌H9C2細(xì)胞活性、凋亡和氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 與anti-miR-con組比較，anti-miR-574-3p組細(xì)胞活性、CyclinD1蛋白表達(dá)水平、SOD含量升高，miR-574-3p表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平、MDA含量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表3。

表3 轉(zhuǎn)染anti-miR-con、anti-miR-574-3p后2組缺氧/復(fù)氧心肌H9C2細(xì)胞活性、凋亡和氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

圖2 轉(zhuǎn)染后2組H9C2細(xì)胞CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白免疫印跡圖

2.5高劑量瑞芬太尼組轉(zhuǎn)染anti-miR-con、anti-miR-574-3p后缺氧/復(fù)氧心肌H9C2細(xì)胞活性、凋亡和氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 與高劑量+miR-con組比較，高劑量+miR-574-3p組細(xì)胞活性、CyclinD1蛋白表達(dá)水平、SOD含量降低，miR-574-3p表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平、MDA含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3、表4。

表4 高劑量瑞芬太尼對(duì)轉(zhuǎn)染anti-miR-con、anti-miR-574-3p后2組缺氧/復(fù)氧心肌H9C2細(xì)胞活性、凋亡率和氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

圖3 高劑量瑞芬太尼組轉(zhuǎn)染anti-miR-con、anti-miR-574-3p后2組缺氧/復(fù)氧心肌H9C2細(xì)胞CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白免疫印跡圖

3 討論

心肌缺血再灌注損傷可加重心肌功能障礙及心肌組織損傷，研究發(fā)現(xiàn)麻醉藥物預(yù)處理可明顯減輕心肌細(xì)胞損傷，還可抑制氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡[9]。miRNA在多種心血管疾病中表達(dá)異常，并可通過(guò)靶向調(diào)控下游靶mRNA表達(dá)減緩心血管疾病的發(fā)展進(jìn)程[10-11]。但麻醉藥物是否可通過(guò)調(diào)控miRNA發(fā)揮作用尚未被闡明。瑞芬太尼可抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及肺泡細(xì)胞凋亡，從而減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷[12]。瑞芬太尼可減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，并可抑制神經(jīng)元凋亡[13]；還可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡從而減輕腎缺血再灌注損傷[14]。研究表明CyclinD1能夠與CDK4結(jié)合形成復(fù)合物，從而正向調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖[15]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞活性和CyclinD1蛋白水平降低，凋亡率升高；與模型組比較，瑞芬太尼各劑量組細(xì)胞活性和CyclinD1蛋白水平升高，凋亡率降低，且隨劑量的增加變化更顯著。提示缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中細(xì)胞活性和CyclinD1蛋白水平降低，瑞芬太尼可促進(jìn)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖。

心肌細(xì)胞活性和CyclinD1蛋白表達(dá)水平升高，提示線粒體途徑激活后可促使Caspase-3活化而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組心肌細(xì)胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平升高；與模型組比較，瑞芬太尼各劑量組心肌細(xì)胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平降低，提示瑞芬太尼可抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，模型組MDA含量升高，SOD含量降低，與既往研究結(jié)果相似[17]。本研究結(jié)果顯示，瑞芬太尼各劑量組MDA含量降低，SOD含量升高，提示瑞芬太尼可增強(qiáng)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞抗氧化能力，但其分子機(jī)制尚需進(jìn)一步探究。

本研究結(jié)果顯示，模型組miR-574-3p的表達(dá)水平升高，而瑞芬太尼各劑量組心肌細(xì)胞中miR-574-3p的表達(dá)水平降低，提示瑞芬太尼可能通過(guò)下調(diào)miR-574-3p的表達(dá)而減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。miR-574-3p在食管癌、卵巢癌、白血病中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。本研究結(jié)果顯示，抑制miR-574-3p表達(dá)后缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活性升高，凋亡率降低，MDA含量降低，SOD含量升高，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-574-3p過(guò)表達(dá)可拮抗瑞芬太尼對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活性、凋亡及氧化應(yīng)激。

綜上所述，瑞芬太尼可通過(guò)下調(diào)miR-574-3p的表達(dá)而增強(qiáng)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活性及抗氧化能力；并可抑制心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)而減輕心肌細(xì)胞損傷，為心血管疾病患者圍術(shù)期合理使用鎮(zhèn)痛藥物瑞芬太尼提供理論依據(jù)；還可為保護(hù)患者心功能提供新的治療靶點(diǎn)及方向。