樊麗超，左秀美，周立春

腦缺血再灌注神經(jīng)損傷因具有高致殘性和高病死率被臨床醫(yī)生及學(xué)者廣泛研究[1]，病理生理學(xué)研究證實,該病是多種途徑共同作用的結(jié)果，如氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和血腦屏障破壞等[2-4]。因此，降低氧化應(yīng)激水平和(或)抑制神經(jīng)炎癥是潛在治療腦缺血再灌注損傷的有效手段。

核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)是抗氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)中的重要轉(zhuǎn)錄因子[5]。4-辛基衣康酸(4-OI)是衣康酸的主要衍生物之一，具有細胞滲透性，可通過烷基化kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1(Keap1)的半胱氨酸殘基激活Nrf2信號[6-7]。體外研究發(fā)現(xiàn)，4-OI能夠激活Nrf2信號級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致Keap1-Nrf2分離、Nrf2胞漿積累和核易位，從而促進Nrf2依賴基因[血紅素氧合酶-1(HO-1)、醌氧化還原酶1和谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基]的表達；4-OI預(yù)處理可顯著抑制過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，降低活性氧產(chǎn)生，從而抑制成骨細胞凋亡[5]。此外，4-OI還可減輕H2O2誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化效應(yīng)、DNA結(jié)構(gòu)損傷及神經(jīng)細胞凋亡，shRNA或CRISPR/Cas9介導(dǎo)的Nrf2基因敲除消除4-OI的神經(jīng)細胞保護作用[7]。衣康酸二甲酯(DMI)是另一種衣康酸衍生物[8]。在心肌缺血再灌注模型和缺血性腦卒中模型中，DMI可降低梗死面積，具有顯著保護作用。既往研究表明,DMI促進Nrf2表達，降低氧化應(yīng)激水平及白細胞介素-1β(IL-1β)含量[9-10]。4-OI是優(yōu)于DMI的衣康酸衍生物，但目前4-OI在大腦中動脈栓塞(tMCAO)模型中的研究較少。因此本研究擬探討4-OI在tMCAO模型大鼠中的保護作用及可能的病理機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗試劑：4-OI(MedChemExpress)、2,3,5三苯基四氮唑氯化鈉(TTC，Sigma-Aldrich)、戊巴比妥鈉(隆盛化工)、生理鹽水(辰欣藥業(yè))、磷酸鹽緩沖液(PBS，美侖生物)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)分析試劑盒(Sigma-Aldrich)、IL-1β的ELISA定量檢測試劑盒(Abcam)、BCA蛋白定量試劑盒(ThermoFisher)、兔抗Nrf2(Abcam)、兔抗HO-1(Abcam)、兔抗硫氧還蛋白互作蛋白(TXNIP) (Proteintech)、兔抗核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)(Abcam)、兔抗β-actin(Abcam)、辣根過氧化物酶(HPR)-山羊抗兔二抗(Santa Cruz)、ECL顯色液(Amersham Bioscience)。

1.1.2實驗儀器：搖床(點成生物)、酶標儀(ThermoFisher)、電泳系統(tǒng)(Invitrogen)、凝膠成像系統(tǒng)(Invitrogen)、冰凍切片機(ThermoFisher)。

1.1.3實驗動物：雄性清潔級SD大鼠36只購于首都醫(yī)科大學(xué)。實驗動物許可證號：AEE1-2020-090。本實驗經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審批通過。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組及造模：將SD大鼠采用隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組和治療組。對照組和模型組腹腔注射生理鹽水，治療組腹腔注射4-OI，注射劑量按100 mg/kg計算[9]。參照Longa等[11]報道的“線栓法”構(gòu)建tMCAO大鼠模型：清潔級SD大鼠禁食12 h，腹腔注射4%戊巴比妥鈉溶液(50 ml/kg)麻醉大鼠；脫掉頸部毛發(fā)，75%乙醇消毒，于頸中線造2 cm切口，鈍性分離頸前肌和右側(cè)胸鎖乳突肌，暴露右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內(nèi)動脈(ICA)；ECA近心端處采用手術(shù)線結(jié)扎，ICA和CCA用血管夾暫時夾閉，在距離CCA分叉約6 mm處造“V”型切口，置入直徑約0.18 mm的線栓，分別經(jīng)CCA和ICA分叉處進入ICA顱骨分支；線栓固定1 h后取出，恢復(fù)血流完成造模。術(shù)后動物置于恒溫控制(37.0±0.5)℃的紅外線燈下至其蘇醒。對照組大鼠處理同模型組，其區(qū)別在于對照組不插入線栓。

1.2.2神經(jīng)功能評分：采用Longa腦損傷評分表[11]評估大鼠腦損傷程度。納入評分為2～3分大鼠，剔除評分較高或較低大鼠，每組12只。隨后在造模后24 h評估各組大鼠神經(jīng)功能，具體評分標準：0分為無神經(jīng)功能損傷，1分為不能伸張結(jié)扎對側(cè)前爪，2分為向結(jié)扎對側(cè)轉(zhuǎn)圈，3分為向結(jié)扎對側(cè)傾斜，4分為無法自主行走，5分為基本無意識。

1.2.3腦梗死評估：tMCAO造模24 h后，每組大鼠隨機選取6只，腹腔注射4%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉；灌注預(yù)冷PBS液，分離大鼠腦組織，經(jīng)冷凍切片，將腦組織切成為2 mm厚的冠狀切面，隨后腦切片在37℃，2%TTC避光孵育30 min，染色結(jié)束后放入4%可溶性聚四氟乙烯中4℃固定過夜。次日，拍照。白色區(qū)域為腦組織梗死區(qū)，紅色區(qū)域為腦組織非梗死區(qū)。用IPP 6.0計算切片的梗死面積,腦梗死面積百分比=梗死面積/腦組織總面積×100%。

1.2.4MDA、SOD和IL-1β含量檢測：再灌注24 h后麻醉大鼠，心臟灌注后取缺血側(cè)新鮮的大腦皮質(zhì)組織，將其表面的附屬物去除，生理鹽水充分清洗，制作濃度為10%的腦勻漿。MDA、SOD和IL-1β含量檢測參照各試劑盒說明書。

1.2.5蛋白檢測：分離梗死區(qū)腦半球組織，RIPA液裂解后，BCA蛋白定量檢測蛋白含量；取25 μg蛋白上樣電泳，以β-actin作為內(nèi)參，檢測Nrf2、HO-1、NXNIP和NLRP3蛋白相對表達量。一抗孵育液濃度分別為Nrf2(1∶1000)、HO-1 (1∶1000)、TXNIP(1∶500)、NLRP3(1∶500)、β-actin抗體(1∶2500)，于4℃緩慢水平搖動孵育過夜；充分清洗3次，按比例加入二抗(1∶3000)，室溫孵育1 h。按照ECL plus化學(xué)發(fā)光試劑盒使用者手冊操作步驟進行顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃描并拍照。目標蛋白相對表達量為目標蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1大鼠神經(jīng)功能損傷比較 3組大鼠的神經(jīng)功能評分分別為對照組(0.50±0.20)分、模型組(4.40±0.50)分、治療組(3.20±0.40)分。與對照組比較，模型組神經(jīng)功能評分增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，治療組神經(jīng)功能評分降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

圖1 3組大鼠神經(jīng)功能損傷比較

2.2大鼠腦梗死面積百分比比較 3組大鼠腦梗死面積百分比分別為對照組(1.26±0.13)%、模型組(18.93±3.46)%、治療組(11.82±1.87)%。與對照組比較，模型組腦梗死面積百分比顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，治療組腦梗死面積百分比降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

圖2 3組大鼠腦梗死面積比較

2.3大鼠腦組織中MDA和SOD含量比較 3組大鼠腦組織中MDA含量分別為對照組(1.02±0.16 )nmol/mg、模型組(7.56±0.43)nmol/mg、治療組(4.79±0.48)nmol/mg。3組大鼠腦組織中SOD含量分別為對照組(16.63±2.22 )U/mg、模型組(5.82±1.45)U/mg、治療組(10.57±1.81)U/mg。與對照組比較，模型組MDA含量顯著升高，SOD含量顯著降低，差異有統(tǒng)計意義(P<0.01)。與模型組比較，治療組MDA含量顯著降低，SOD含量顯著增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。

圖3 3組大鼠腦組織中MDA和SOD含量比較

2.4大鼠腦組織中IL-1β含量比較 3組大鼠腦組織中IL-1β含量分別為對照組(157.81±26.24)nmol/mg、模型組(298.54±38.29)nmol/mg、治療組為(226.76±25.35)nmol/mg。與對照組比較，模型組IL-1β含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，治療組IL-1β含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖4。

圖4 3組大鼠腦組織中IL-1β水平比較

2.54-OI對Nrf2/HO-1和TXNIP/NLRP3信號通路的影響 與對照組比較，模型組和治療組Nrf2、HO-1蛋白表達量顯著增高，且治療組高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與對照組比較，模型組和治療組TXNIP、NLRP3蛋白表達量顯著增高，但治療組低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖5、6。

圖5 3組大鼠腦組織Nrf2/HO-1/TXNIP信號通路相關(guān)蛋白免疫印跡圖

3 討論

越來越多研究表明，氧化應(yīng)激水平升高是腦缺血再灌注導(dǎo)致神經(jīng)損傷的重要因素之一[12-13]。髓過氧化物酶是中性粒細胞活化過程中分泌的一種蛋白，是反映炎癥程度的指標之一；而SOD是機體中一種重要的抗氧化酶[14]。研究證實在腦缺血再灌注引起的腦組織損傷中氧化終產(chǎn)物MDA含量升高，而具有抗氧化作用的SOD含量降低[15-16]，提示氧化應(yīng)激水平異常改變與腦缺血再灌注損傷密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，治療組MDA含量降低，SOD水平升高。因此，4-OI對腦缺血再灌注模型大鼠腦組織損傷起保護作用，可能與其能夠降低氧化應(yīng)激水平有關(guān)。

NLRP3炎性小體在缺血再灌注腦損傷過程中起重要作用[17-18]，其可通過Caspase-1促進炎性細胞因子如IL-1β的合成與釋放[19]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠腦組織中NLRP3蛋白表達量升高。提示4-OI預(yù)處理可降低NLRP3蛋白水平，抑制tMCAO誘導(dǎo)的IL-1β含量,從而發(fā)揮抗炎作用。此外，NLRP3與TXNIP之間具有強烈的相互作用[17]。在急性腎損傷和糖尿病的研究中均證實，TXNIP與NLRP3結(jié)合并可協(xié)同激活炎性小體[20-21]。在腦缺血再灌注損傷模型中，TXNIP和NLRP3表達具有相同趨勢[22-23]。本研究結(jié)果顯示，模型組TXNIP表達量顯著升高，治療組TXNIP表達水平顯著降低。與前期研究結(jié)果一致，提示通過抑制NLRP3炎性小體可降低炎性因子IL-1β的合成與釋放。此外，有研究表明，在急性腦缺血損傷模型中，Nrf2的激活減弱了TXNIP和NLRP3炎性小體的表達[17]；本研究結(jié)果與既往研究結(jié)果一致。在腦缺血再灌注模型中，由于異常氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，導(dǎo)致Nrf2及其下游HO-1蛋白表達升高，機體啟動“自我保護”程序。在此基礎(chǔ)上，預(yù)防性給予4-OI可進一步提高Nrf2和HO-1蛋白表達量，從而抑制TXNIP/NLRP3的激活，降低IL-1β炎性因子釋放和炎癥反應(yīng)，可發(fā)揮保護腦組織的作用。

圖6 4-OI對Nrf2/HO-1/TXNIP信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

本研究首次驗證了4-OI在腦缺血再灌注模型大鼠腦組織損傷中的保護作用及病理和分子機制，為以4-OI為基礎(chǔ)的藥物開發(fā)和臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。但研究也存在一定的不足之處，臨床中缺血性腦卒中類型多樣，tMCAO再灌注模型并不能完全模擬臨床腦缺血再灌注發(fā)病情況。此外，機體抗氧化通路和炎癥通路多樣，4-OI或許亦可通過其他通路發(fā)揮作用，有待進一步深入探究。

綜上所述，4-OI可減小腦組織梗死區(qū)域，改善神經(jīng)功能，因此在腦缺血再灌注損傷中起保護作用，其機制與Nrf2/HO-1抗氧化通路增強和TXNIP/NLRP3炎癥信號通路抑制有關(guān)，提示4-OI具有開發(fā)預(yù)防tMCAO藥物的潛質(zhì)。