張豪洋 黨炳俊 金伊楠 李子瑋 孫燕鑫 郭笑恒 許自成

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002)

我國(guó)是煙草種植大國(guó)，植煙面積超過(guò)100萬(wàn)hm2，年均產(chǎn)生的煙草廢棄物多達(dá)400萬(wàn)t[1]。煙草廢棄物中含有大量有害物質(zhì)，如煙堿、氨基聯(lián)苯等，隨意排放會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類(lèi)健康造成嚴(yán)重危害。美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(EPA)早在1994年就在環(huán)境限制釋放目錄清單中加入煙堿，歐盟也有相關(guān)法律規(guī)定，當(dāng)煙草廢棄物中煙堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于0.05%時(shí)，即被歸類(lèi)為有害危險(xiǎn)廢棄物，需謹(jǐn)慎處理。然而，煙草廢棄物中含有茄尼醇等重要化合物[2]155，其獨(dú)特的物質(zhì)組成及物理特性使其具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

由于人們對(duì)煙草的清潔生產(chǎn)和煙草廢棄物的資源化利用意識(shí)相對(duì)較弱，導(dǎo)致大量的煙草廢棄物不能得到及時(shí)有效處理。煙草廢棄物的資源化、經(jīng)濟(jì)化利用已成為煙草行業(yè)發(fā)展亟待解決的問(wèn)題。目前，煙草廢棄物的資源化途徑主要有3種：(1)提取煙草廢棄物中的重要化合物；(2)將煙草廢棄物制成功能型材料[3]；(3)將煙草廢棄物堆肥制成有機(jī)肥。煙草廢棄物資源化利用前，先要妥善處理其中的煙堿。煙堿又名尼古丁，是由吡啶環(huán)與吡咯環(huán)組成的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的有毒雜環(huán)化合物，廣泛存在于多種茄科(Solanaceae)植物中，是煙草中含量最多的一種生物堿[4]，其對(duì)環(huán)境可造成一定危害。微生物降解煙堿具有降解能力強(qiáng)、功能微生物種類(lèi)豐富、降解途徑多樣、對(duì)環(huán)境影響小等特性，是一種低成本、高效率的煙堿處理方法。因此，通過(guò)微生物材料以及生物調(diào)控技術(shù)對(duì)煙草廢棄物進(jìn)行處理，在提高煙草資源利用率、增強(qiáng)土壤肥力和保護(hù)生態(tài)環(huán)境等方面具有重要意義。因此，本研究對(duì)煙草廢棄物中煙堿生物調(diào)控技術(shù)進(jìn)行了綜述，以期為處理煙草廢棄物、降低煙堿含量以及緩解環(huán)境污染等研究提供參考。

1 煙堿的危害及污染來(lái)源

1.1 煙堿的危害

煙堿是一種有毒的雜環(huán)化合物，純煙堿在室溫下為無(wú)色或淡黃色的油狀液體，在低于60 ℃時(shí)可與水以任意比例混合，也可溶于醇類(lèi)、醚類(lèi)和氯仿等有機(jī)溶劑[5]。煙堿在自然條件下不易被降解，且易溶于水，容易通過(guò)淋溶作用進(jìn)入土壤和地下水，造成土壤和水污染，破壞生態(tài)平衡。煙堿進(jìn)入人體后會(huì)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的煙堿型乙酰膽堿受體相結(jié)合，進(jìn)而對(duì)人體的多種組織和細(xì)胞造成損害[6]。煙堿還會(huì)增加血漿的濃度，導(dǎo)致心血管等諸多部位疾病發(fā)病率的升高[7]。

1.2 煙堿的污染來(lái)源

造成環(huán)境污染的煙堿主要來(lái)源于煙草廢棄物，煙草中煙堿含量可占煙草生物堿總量的95%[8]，煙草廢棄物中的煙堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)0.5%～8.0%。除此之外，煙堿污染的另一大源頭是新煙堿型農(nóng)藥。近年來(lái)，新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑吡蟲(chóng)啉、噻蟲(chóng)嗪和啶蟲(chóng)脒憑借其高效、廣譜等特點(diǎn)，已成為我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用的第四大類(lèi)農(nóng)藥，廣泛應(yīng)用于果蔬的病蟲(chóng)害防治中[9]。隨著新煙堿型農(nóng)藥的廣泛使用，其對(duì)人類(lèi)健康的影響和對(duì)生態(tài)環(huán)境的污染已成為科技工作者們必須面對(duì)和研究的問(wèn)題，經(jīng)過(guò)多年的研究發(fā)現(xiàn)，兩種來(lái)源的煙堿都可通過(guò)具有煙堿降解能力的微生物進(jìn)行控制和解決。

2 煙堿生物調(diào)控技術(shù)

2.1 可降解煙堿的微生物種類(lèi)

現(xiàn)階段的煙堿調(diào)控技術(shù)大多通過(guò)農(nóng)藝措施和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑來(lái)調(diào)控?zé)煵蒹w內(nèi)煙堿的合成，如打頂、抹杈、減少氮肥施用量和葉片噴施藥劑等[10]。除此之外，常規(guī)的物理化學(xué)方法也可以降解煙堿，但這些方法不僅耗費(fèi)時(shí)間且價(jià)格高昂。目前，針對(duì)煙堿的生物調(diào)控領(lǐng)域研究主要集中在微生物降解上，微生物作為自然界中廣泛存在的微小生物體，是物質(zhì)循環(huán)必不可少的推動(dòng)者，其在調(diào)控?zé)煵輳U棄物中的煙堿含量上發(fā)揮著積極的作用且具有重要應(yīng)用前景。迄今為止，已經(jīng)報(bào)道的可降解煙堿的微生物主要為細(xì)菌，真菌相對(duì)較少。可降解煙堿的細(xì)菌中50%以上屬于節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)[11]和假單胞菌屬(Pseudomonas)[12]，其他菌株大多為產(chǎn)堿菌(Alcaligenes)、無(wú)色桿菌屬(Achromobacter)[13-14]、芽孢桿菌屬(Bacillus)[15]和中間蒼白桿菌屬(Ochrobactrumintermediate)等[16]。煙堿降解菌大多為好氧微生物，主要通過(guò)礦化方式對(duì)煙堿進(jìn)行降解，且這些菌株具有較強(qiáng)的耐煙堿性，可將煙堿轉(zhuǎn)化為羧酸和氨基酸，從而起到降解有毒有害廢棄物的作用。目前國(guó)內(nèi)外大批研究人員從煙葉、土壤和卷煙廠廢棄物中分離得到的多種煙堿降解菌及其最佳降解條件匯總于表1。

表1 具有煙堿降解能力的菌株

2.2 微生物降解煙堿的代謝途徑

微生物降解煙堿的途徑主要有吡啶途徑、吡咯烷途徑、脫甲基以及吡啶和吡咯烷交叉途徑等[42-44]。

2.2.1 吡啶途徑

節(jié)桿菌屬微生物主要通過(guò)吡啶途徑降解煙堿。在吡啶途徑中，菌株先將煙堿吡啶環(huán)羥基化形成6-羥基煙堿，然后再將吡咯環(huán)氧化形成6-羥基-N-甲基麥斯明，并自發(fā)水解生成6-羥基假氧化煙堿[45]。隨后通過(guò)羥基化反應(yīng)生成2，6-二羥基假氧化煙堿，繼而重復(fù)自發(fā)水解過(guò)程生成γ-N-甲基氨基丁酸和3,6-二羥基吡啶，其中γ-N-甲基氨基丁酸可生成γ-氨基丁酸，3,6-二羥基吡啶繼續(xù)反應(yīng)生成2,3,6-三羥基吡啶和馬來(lái)酸[46]。煙堿吡啶途徑的代謝通路見(jiàn)圖1。

圖1 吡啶途徑Fig.1 Pyridine pathway

2.2.2 吡咯烷途徑

吡咯烷途徑始于吡咯烷環(huán)中碳氮鍵的氧化，是假單胞菌屬的主要代謝途徑。在該途徑中煙堿首先脫氫生成6-羥基-N-甲基麥斯明，自發(fā)水解生成假氧化煙堿，實(shí)現(xiàn)吡咯環(huán)的打開(kāi)，而后吡咯環(huán)脫甲胺生成3-琥珀酰吡啶，隨后通過(guò)羥基化反應(yīng)生成6-羥基-3-琥珀酰吡啶，最后生成2，5-二羥基吡啶和琥珀酸鹽，逐步完成煙堿的分解[21]1495。煙堿吡啶烷途徑的代謝通路見(jiàn)圖2。

圖2 吡咯烷途徑Fig.2 Pyrrole pathway

2.2.3 脫甲基途徑

脫甲基途徑的第1步是吡咯環(huán)進(jìn)行脫甲基化反應(yīng)，其代謝產(chǎn)物也是2，5-二羥基吡啶和琥珀酸。但與該途徑各步反應(yīng)中的酶類(lèi)和相關(guān)的基因描述很少，具體代謝通路還有待進(jìn)一步研究[21]1496。

2.2.4 吡啶和吡咯烷交叉途徑

WANG等[29]研究證實(shí)在AgrobacteriumS33中存在吡啶和吡咯烷交叉途徑。并從該途徑中檢測(cè)出5種中間產(chǎn)物，其中6-羥基煙堿、6-羥基-N-甲基麥斯明和6-羥基假氧化煙堿與吡啶途徑的中間產(chǎn)物一致，6-羥基-3-琥珀酰吡啶和2,5-二羥基吡啶與吡咯烷途徑的中間產(chǎn)物相同。

2.2.5 其他途徑

近年來(lái)，隨著科研工作者對(duì)微生物降解煙堿代謝途徑和降解機(jī)理的研究不斷深入，新的煙堿代謝產(chǎn)物陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。孫柯丹[31]在研究菌株P(guān)seudomonassp. ZUTSKD對(duì)煙堿的降解產(chǎn)物時(shí)發(fā)現(xiàn)了2,3-二吡啶、3-(2,3,4-三氫-5-吡咯基)-吡啶和可替寧等物質(zhì)，推測(cè)菌株P(guān)seudomonassp. ZUTSKD降解煙堿的第1步可能是通過(guò)可替寧脫甲基反應(yīng)后生成3-(2,3,4-三氫-5-吡咯基)-吡啶。因此，菌株P(guān)seudomonassp. ZUTSKD對(duì)煙堿可能有新的降解途徑。另有學(xué)者通過(guò)分析菌株P(guān)seudomonassp.HF-1降解煙堿的中間產(chǎn)物時(shí)發(fā)現(xiàn)了麥思明等物質(zhì)[23]。RAMAN等[38]通過(guò)高效液相色譜(HPLC)和氣質(zhì)聯(lián)用色譜(GC/MS)等對(duì)菌株P(guān)seudomonasplecoglossicidaTND35降解煙堿的過(guò)程進(jìn)行研究，并檢測(cè)出3種新的未知中間產(chǎn)物。煙堿降解菌中仍存在許多未知的代謝途徑有待進(jìn)一步探索，后期可從已知酶入手進(jìn)行機(jī)制研究，也可對(duì)一些涉及的酶進(jìn)行鑒定，或通過(guò)生物工程的手段對(duì)已知途徑進(jìn)行改造以生產(chǎn)出更加有用的合成中間體。

2.3 煙堿生物調(diào)控的研究動(dòng)態(tài)

早在20世紀(jì)中葉國(guó)外就已經(jīng)開(kāi)展了煙堿降解的相關(guān)研究。1954年WADA等[2]156從土壤中分離出細(xì)菌A和細(xì)菌B，它們可利用煙堿作為氮和碳的唯一來(lái)源進(jìn)行生長(zhǎng)代謝，并觀察到在細(xì)菌A和細(xì)菌B存在時(shí)煙草生物堿和相關(guān)化合物可被吸收。HONG等[33]從煙草種植土壤中分離出細(xì)菌菌株ND12，該菌株可利用煙堿作為唯一的碳和氮源，在28 ℃、pH=6.0的條件下14 h內(nèi)完全降解1.0 g/L煙堿，ND12菌株生長(zhǎng)的最佳煙堿質(zhì)量濃度為2.5 g/L。WANG等[41]研究發(fā)現(xiàn)，SphingomonasmelonisTY菌株可利用煙堿作為唯一的碳、氮源生長(zhǎng)，且該菌株通過(guò)NdpT這類(lèi)煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白來(lái)完成煙堿的降解。SHANG等[47]研究菌株P(guān)hanerochaetechrysosporium、Bacillusthuringiensis時(shí)發(fā)現(xiàn)它們可通過(guò)調(diào)節(jié)土壤氮含量進(jìn)而降低煙葉中的煙堿含量并改善煙草質(zhì)量。WANG等[48]將具有高效煙堿降解能力的Pseudomonassp. HF-1添加到被煙草廢棄物污染的土壤中，與對(duì)照組相比，添加HF-1菌株的土壤表現(xiàn)出更強(qiáng)的污染處理能力、更高的pH和穩(wěn)定的水分含量，且HF-1菌株可在土壤中持續(xù)存在，從而大大提高了煙草廢棄物的處理效率。ZHU等[49]對(duì)Sphingomonassp. NIC1菌株的完整基因組序列進(jìn)行分析，證實(shí)其可有效降解煙堿。GONG等[50]研究發(fā)現(xiàn)Rhodococcussp. Y22擴(kuò)增可得到煙堿脫氫酶ndh的編碼基因，并且在煙堿誘導(dǎo)下，該菌株的轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，具有較強(qiáng)的煙堿降解能力，可從煙草廢棄物中降解煙堿以達(dá)到環(huán)境要求。MIHASAN等[51]利用微生物蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)PaenarthrobacternicotinovoranspAO1中的煙堿代謝途徑進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其降解途徑是由包含約40個(gè)與煙堿相關(guān)的基因組成的分解代謝質(zhì)粒pAO1編碼操控，該細(xì)菌能夠利用煙堿作為碳源，在較低煙堿含量下進(jìn)行脫氨和脫甲基之間的切換，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)煙堿的降解。LI等[52]從海洋沉積物中分離出具有煙堿降解能力的細(xì)菌JQ581，根據(jù)形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA基因分析將其鑒定為假單胞菌屬成員，且煙堿降解中間體為假氧化煙堿和3-琥珀酰吡啶，并通過(guò)基因組序列分析發(fā)現(xiàn)該菌株含有煙堿降解的基因簇。LI等[53]從富含煙堿的環(huán)境中分離出可降解和耐受高含量煙堿的Pseudomonassp. JY-Q菌株，發(fā)現(xiàn)nicA2和nox基因都參與了煙堿的降解，此外hpo1和hpo2基因在降解過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。MARIUS等[54]通過(guò)蛋白組學(xué)方法對(duì)細(xì)菌Paenarthrobacternicotinovorans中的質(zhì)粒pAO1進(jìn)行分析，使用納米液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(nanoLC-MS/MS)鑒定出聚在511個(gè)非冗余蛋白簇中的801個(gè)蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)豐度的差異表明，當(dāng)檸檬酸鹽存在時(shí)，脫氨效果較好。

國(guó)內(nèi)關(guān)于煙草廢棄物中煙堿生物調(diào)控的研究起步較晚。袁勇軍等[55]發(fā)現(xiàn)了一種能降解煙堿的細(xì)菌并命名為DN2，經(jīng)過(guò)鑒定該菌屬于中間蒼白桿菌屬，其對(duì)煙堿的最佳降解條件為30 ℃、pH 6.5。韓娜娜[56]從煙草廢棄物污染的土壤中篩選出一株煙堿降解細(xì)菌并將其命名為中間蒼白桿菌E3，其在pH 7.0、35 ℃、酵母膏添加量1.0 g/L的條件下對(duì)煙草加工廢水中的煙堿降解率可達(dá)100%。龍章德等[57]從植煙土壤中篩選出一株可耐受8 g/L煙堿的菌株，并將其命名為Microbacteriumsp. GYC29，其煙堿降解率可達(dá)82%。李天麗等[58]從醇化煙葉中分離得到具有降解煙堿活性的菌群(Q6)，并在該菌群的煙堿代謝產(chǎn)物中檢測(cè)到煙堿烯、2,3’-聯(lián)吡啶和可替寧的存在，這些物質(zhì)與煙葉品質(zhì)關(guān)聯(lián)密切，因此可以通過(guò)微生物降解醇化煙葉中的煙堿從而達(dá)到改善煙葉品質(zhì)的目的。洪駿[59]利用具有煙堿降解能力的菌株Shinellasp. HZN7對(duì)被煙草廢棄物污染的土壤進(jìn)行修護(hù)，發(fā)現(xiàn)菌液添加量為100 g/kg時(shí)對(duì)土壤的修復(fù)效果最好，可有效去除土壤中的煙堿殘留，對(duì)保護(hù)土壤生態(tài)環(huán)境起到了積極作用。劉彩紅[60]從一個(gè)新的角度對(duì)煙草廢棄物進(jìn)行處理，通過(guò)淀粉酶酶解作用將煙草廢棄物中的有害物質(zhì)降解為可再利用的葡萄糖等小分子化合物，再經(jīng)過(guò)加工合成酶解濃縮液，酶解濃縮液可與L-丙氨酸發(fā)生美拉德反應(yīng)，進(jìn)一步提升卷煙香氣，實(shí)現(xiàn)煙草廢棄物的資源化利用。汪美貞[61]通過(guò)質(zhì)粒消除轉(zhuǎn)化和關(guān)鍵基因hsp的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈擴(kuò)增(RT-PCR)等方法證明了質(zhì)粒pMH1是不同于pAO1的新型煙堿降解質(zhì)粒，該質(zhì)?？赡芎泻蜔焿A降解相關(guān)的hsp和amo基因。目前已有研究證實(shí)生物調(diào)控技術(shù)對(duì)煙草廢棄物中的煙堿降解具有積極作用，且已發(fā)現(xiàn)降解率較高的菌屬以及新的研究方向。

目前我國(guó)煙草廢棄物資源化利用效率不高，主要原因是其中的煙堿無(wú)法得到快速有效處理。微生物種類(lèi)和降解機(jī)制的多樣性為卷煙的制造加工和煙草廢棄物污染的處理提供了更加豐富的資源和更加多樣化的選擇，但因微生物降解煙堿的機(jī)制較為復(fù)雜，對(duì)降解方式和降解機(jī)制的研究還不夠細(xì)化，因此目前這項(xiàng)技術(shù)還沒(méi)有高效地應(yīng)用于實(shí)踐中，后續(xù)可以加深煙堿生物調(diào)控從基礎(chǔ)研究向應(yīng)用研究的轉(zhuǎn)化。

2.4 生物調(diào)控技術(shù)的其他應(yīng)用

在煙草生產(chǎn)過(guò)程中污水處理廠面臨大量含煙堿的廢水無(wú)法解決的問(wèn)題，通過(guò)具有煙堿降解能力的微生物或生物催化劑進(jìn)行調(diào)控，可以有效降低煙堿對(duì)人體和生態(tài)環(huán)境所造成的危害，對(duì)緩解煙草廢棄物造成的環(huán)境污染起到積極作用。我國(guó)多數(shù)卷煙廠儲(chǔ)存上部煙葉，但上部煙葉的煙堿含量偏高，通常不易在卷煙配方中使用，而利用微生物降解煙堿可改善煙葉的內(nèi)在品質(zhì)，提高煙葉資源的利用率。通過(guò)煙堿的生物調(diào)控技術(shù)處理煙葉不僅能夠減少煙葉在倉(cāng)庫(kù)中的陳化發(fā)酵時(shí)間，降低包括煙堿、蛋白質(zhì)和亞硝胺等有害物質(zhì)的含量，還可在不破壞煙葉抽吸品質(zhì)的同時(shí)提高質(zhì)量，防止煙葉受潮變質(zhì)。

3 展 望

降低煙草廢棄物中煙堿的含量，減少煙堿對(duì)環(huán)境的危害，是煙草廢棄物資源化處理的首要任務(wù)。微生物對(duì)煙堿的耐受性極高，可將煙堿作為碳、氮和能量的唯一來(lái)源，通過(guò)不同的代謝途徑將煙堿降解為低危害或可再利用的無(wú)害物質(zhì)。

目前煙堿生物調(diào)控技術(shù)仍有許多問(wèn)題有待解決，如生物調(diào)控技術(shù)多側(cè)重于微生物調(diào)控，其他調(diào)控技術(shù)還有待發(fā)現(xiàn)；微生物種類(lèi)和降解途徑繁多，沒(méi)有系統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行歸類(lèi)匯總；缺乏縱向的深入研究，調(diào)控機(jī)制尚不完全清晰等。在未來(lái)的研究中，可通過(guò)觀察卷煙生產(chǎn)過(guò)程中各時(shí)期微生物的變化，探尋合適的微生物制劑施用時(shí)間和施用方法，為微生物在煙草中的合理利用提供更加可靠的技術(shù)支持；對(duì)煙堿的生物調(diào)控代謝機(jī)制研究可通過(guò)酶學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)找到關(guān)鍵酶及其基因，并通過(guò)基因工程對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行克隆、編輯和修飾等，使生物調(diào)控?zé)焿A的能力提高；隨著基因組學(xué)的不斷發(fā)展，可通過(guò)基因組學(xué)探索除微生物外更多關(guān)于煙堿降解的生物技術(shù)。綜上所述，煙草廢棄物中煙堿生物調(diào)控技術(shù)的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用具有很大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景，能夠?yàn)闊煵萆a(chǎn)加工以及生態(tài)環(huán)境保護(hù)提供技術(shù)支持。