楊文玲 杜志敏 孫召華 周伏忠 安明理 雷 高 魏傳軍 鞏 濤#

(1.河南省科學院生物研究所有限責任公司，河南 鄭州 450008；2.河南省地震局，河南 鄭州 450016)

近年來，隨著我國經(jīng)濟及工業(yè)化的快速發(fā)展，工礦企業(yè)、農(nóng)業(yè)及生活等方面排放的重金屬污染物逐漸增加，土壤重金屬污染已經(jīng)成為制約我國工農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素[1]。2014年《全國土壤污染狀況調查公報》顯示，Cd、Ni、As、Cu、Pb、Hg、Cr、Zn點位超標率合計達到了21.7%[2]。

土壤中重金屬的累積會影響營養(yǎng)元素的存在狀態(tài)，導致土壤質量及生產(chǎn)力下降，重金屬被植物吸收后，對植物的形態(tài)結構、生理代謝、信號傳導及遺傳等方面都會產(chǎn)生毒害作用，嚴重影響植物的生長發(fā)育。重金屬污染最終的后果是影響人類健康，食用、吸入或者暴露于重金屬污染環(huán)境，都將對人體的健康造成直接或間接影響[3]。對重金屬污染環(huán)境進行有效治理，對于提高土壤生產(chǎn)力，改善生態(tài)環(huán)境，保護食品安全，保障人體健康，具有重要的現(xiàn)實意義[4]。微生物修復技術與傳統(tǒng)的理化修復技術相比，具有經(jīng)濟有效、環(huán)境友好、綠色生態(tài)等優(yōu)點，受到了國內(nèi)外學者的廣泛關注，已成為重金屬污染土壤修復領域的熱點。

芽孢桿菌(Bacillus)是一類廣泛存在于耕地、林地、草地等生態(tài)環(huán)境的微生物，他們對外界有害因子抵抗力強，能夠與陸生植物根系形成共生關系，是一種重要的農(nóng)業(yè)促生菌[5]。目前關于芽孢桿菌在重金屬污染治理方面的應用越來越多，其在重金屬污染土壤修復中的作用也越來越得到認可[6]。本研究對重金屬污染土壤芽孢桿菌修復技術進行了分析與總結，并嘗試從基因水平探討芽孢桿菌對重金屬的作用機制，再對重金屬污染土壤修復技術進行了展望，以期讓芽孢桿菌在我國重金屬污染土壤修復中發(fā)揮更大的作用。

1 具有重金屬污染土壤修復功能的芽孢桿菌種類

芽孢桿菌因生長快、表面積大、對環(huán)境要求低、抗逆性強等優(yōu)勢，已在重金屬污染治理中得到了廣泛的應用。表1羅列了近年來對重金屬污染土壤具有修復能力的芽孢桿菌[7-22]，研究較多的有枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌。

表1 具有重金屬污染土壤修復能力的芽孢桿菌

2 芽孢桿菌修復重金屬污染土壤的機理

2.1 生物溶解與沉淀

在重金屬脅迫的條件下，芽孢桿菌可以產(chǎn)生大量的胞外分泌物，如有機酸、蛋白質、多肽、脂類等，這些分泌物可以提供大量的陰離子基團與重金屬通過絡合、螯合等多種方式結合形成沉淀物，降低重金屬的生物毒性[23-24]。SARANYA等[25]將枯草芽孢桿菌與蠟樣芽孢桿菌分泌的脂蛋白類生物表面活性劑用于含鉻廢水的處理，結果顯示在陽離子生物表面活性劑濃度最佳時，通過配位鍵合作用，水溶液中Cr(Ⅲ)的最大去除率達到了98%。HAN等[26]從Cd和Pb污染農(nóng)田白菜根際土壤中分離到重金屬固定化細菌——巨大芽孢桿菌N3，N3可以產(chǎn)生尿素酶、脫落酸和吲哚-3-乙酸，通過胞外吸附和生物沉淀以及提高土壤溶液pH來降低Cd和Pb的毒性，其對白菜葉片Cd和Pb的去除率可分別達到79.7%與83.5%。KHAN等[27]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌可以利用鐵載體的金屬螯合特性來降低環(huán)境中Cd(Ⅱ)的含量，在鐵載體存在下，其對Cd(Ⅱ)的胞內(nèi)積累提高了5.22倍。BELOGOLOVA等[28]在研究根際細菌作用下，含鉛化合物在植物體內(nèi)的遷移轉化及其在植物體內(nèi)的積累時發(fā)現(xiàn)，在接種固氮菌和根際芽孢桿菌的土壤中，Pb的遷移增加；根及根際土壤中的Pb與鐵氫化物螯合，使植物地上部分對Pb的吸收減少。

2.2 生物吸附與富集

生物吸附與富集通過細胞表面的官能團、聚合物等對重金屬吸附后，由細胞的轉運系統(tǒng)將重金屬運送入細胞，被細胞代謝物吸附、固定形成重金屬累積效應。芽孢桿菌胞外聚合物中含有大量的氨基、巰基、羥基、羧基、磷酸基和酰胺基等活性基團，這些基團與重金屬離子結合，從而使環(huán)境中的重金屬離子被吸附[29]。CHEN等[30]研究蠟樣芽孢桿菌12-2對Pb(Ⅱ)吸附時發(fā)現(xiàn)，靜電吸附是主要驅動力，而細菌的羧基、酰胺基和磷酸基為固定Pb(Ⅱ)提供了結合位點。通過靜電吸附、離子交換和功能基團螯合作用的協(xié)同作用，Pb(Ⅱ)快速吸附在蠟樣芽孢桿菌12-2上。SUN等[31]利用地衣芽孢桿菌研究了生物吸附劑對Ag(Ⅰ)的吸附作用，在優(yōu)化條件下，Ag(Ⅰ)的生物吸附量和吸附率分別達到73.6 mg/g和73.6%，傅立葉變換紅外光譜(FTIR)結果表明，在地衣芽孢桿菌中，酰胺基和羧基是與Ag(Ⅰ)結合的主要活性基團。OVES等[32]以蘇云金芽孢桿菌為研究對象，研究了Cd、Cr、Cu、Pb、Ni等重金屬的生物吸附，菌株對Ni、Cu、Cd都表現(xiàn)出了較好的吸附效果(吸附率分別為94.0%、91.8%和87.0%)；FTIR分析顯示氨基、羧基、羥基和羰基參與了重金屬的生物吸附。NAIK等[33]利用蠟樣芽孢桿菌對電鍍廢水中的Cr(Ⅵ)進行了脫毒研究，電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜和原子吸收光譜測定結果顯示，該菌對75%以上的Cr(Ⅵ)有去除作用；用FTIR研究了該菌細胞表面官能團的構象變化，發(fā)現(xiàn)羧基、磷酸基、酰胺基等官能團是Cr(Ⅵ)的吸收和解毒過程中的重要組成部分。

2.3 生物轉化作用

生物轉化作用是指細胞通過氧化還原、甲基化和去甲基化以及生物礦化等作用改變重金屬離子的溶解性、遷移性以及毒性，將高毒態(tài)轉化為無毒態(tài)或低毒態(tài)，從而實現(xiàn)對重金屬解毒的過程。重金屬價態(tài)是決定其毒性的重要因素，芽孢桿菌對重金屬元素的氧化還原是其重要的解毒機制之一，如蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌以及巨大芽孢桿菌可以通過自身分泌的酶改變重金屬存在的價態(tài)，使高毒性的Cr(Ⅵ)還原為低毒性的Cr(Ⅲ)，從而降低Cr的毒性[34]。芽孢桿菌對重金屬的生物礦化作用可降低其生物有效性和遷移能力，如芽孢桿菌KK1能將高毒性的Pb(NO3)2轉化為溶解性較差的PbS以及在常態(tài)下無毒的PbCO3或PbSiO3，將Pb的有效性降低36%[35]。ABDEL MONEM等[36]研究了枯草芽孢桿菌117S對Ni的去除作用，該菌株對Ni的最大吸收量為351.6 μg/mL，進行細胞羧基酯化、細胞氨基甲基化、丙酮抽提菌體脂類或苯抽提菌體脂類處理后，該菌株對Ni的生物去除能力顯著降低了22.0%～64.9%。

3 芽孢桿菌修復重金屬污染土壤的分子生物學研 究進展

3.1 重金屬抗性相關基因

細菌對重金屬的抗性是一個復雜的過程，其作用機制主要是由許多基因在遺傳水平上決定的。隨著基因組學和相關分子生物學的發(fā)展，近年來許多與重金屬抗性相關的基因也得以鑒定與分離，比如，抗汞基因merA、merE，抗銅基因pcoA、pcoR、cusABC，抗鉻基因chrA、chrB，抗鉛基因pbrA、pbrD，抗鎳基因nikA、ncrA等。這些基因從作用機理角度又可分為分別參與Zn/Co/Cr、Zn/Co/Cd、Mn、Ni、Hg和Cu轉運的基因czcABC、mdrL、mncA、nikR/ncrA、merE和copAB/cusABC/pcoR，分別參與Cd、Cu、Ni和Pb生物吸附的基因cadBD、cusF、nikA和pbrD，分別參與Hg、As和Cu氧化還原的基因merA、arsB和pcoA等[37-39]。這些基因的分離與鑒定極大地加速了重金屬抗性菌株的篩選與基因工程菌的構建。比如，HUANG等[40]研究使用rhd和chrA作為PAHs降解和Cr(Ⅵ)抗性的基因標記，從10 284株菌株中篩選到1 195株能夠同時降解有機污染物和抵抗重金屬污染的細菌，其中芽孢桿菌是主要的微生物菌群。AMIN等[41]將抗汞基因merE克隆到pHLV載體中，構建表達重組質粒pHLMerE，轉化大腸桿菌(Escherichiacoli)C43(DE3)細胞進行過表達，獲得了MerE蛋白。

3.2 基因組學在芽孢桿菌修復重金屬污染土壤研究中的應用

近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學和生物信息學的迅猛發(fā)展，對微生物修復的研究也從微生物生理適應現(xiàn)象的宏觀層面發(fā)展到內(nèi)在機制的微觀分子層面。尤其是高通量測序技術的飛速發(fā)展，大量芽孢桿菌基因組測序完成，到目前為止，在Genenbank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Bacillus)公布基因組的芽孢桿菌已達260株以上，可獲得的組裝數(shù)據(jù)達9 900條以上，這些海量的基因組數(shù)據(jù)提供了大量芽孢桿菌遺傳信息資源，為發(fā)掘重金屬抗性新基因及探究抗性機理提供了許多線索和啟示。CABALLERO等[42]對蠟樣芽孢桿菌CITVM-11.1進行了全基因組測序并進行了基因功能的預測，在該基因組中發(fā)現(xiàn)了3個抗砷基因，2個抗銅基因，3個鈷-鋅-鎘抗性基因，1個抗汞基因，1個抗鋁基因，4個抗碲基因。LI等[43]應用基因組序列分析和比較基因組分析方法，研究了芽孢桿菌S3的抗性機制和進化關系，通過分析發(fā)現(xiàn)了30種以上重金屬抗性相關基因，利用基因aioB、arsB和arsC為探針，探討了芽孢桿菌S3中抗銻基因的起源和進化，揭示了芽孢桿菌屬之間的進化關系和水平基因轉移(HGT)事件。嗜熱芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)SK3-4是一株耐鋁嗜熱細菌，LIM等[44]對其轉錄組進行測序發(fā)現(xiàn)，誘導條件下，有708個基因差異表達(倍數(shù)變化>2.00)，其中316個基因被上調，而347個基因被下調，為該菌耐鋁分子機制闡述提供了重要的研究數(shù)據(jù)。

4 展 望

重金屬污染土壤修復技術在實際應用上還存在很多局限，要達到經(jīng)濟與效率的統(tǒng)一也需要長久努力。今后的發(fā)展可以從以下幾個方面入手：

(1) 針對重金屬污染的特點，繼續(xù)開展生長迅速、起效快、耐受性強的高效菌株的篩選與馴化，持續(xù)擴展高效菌株的來源，不斷挖掘可協(xié)同修復的細菌、真菌進行優(yōu)化組合，提高重金屬污染土壤修復效率。

(2) 繼續(xù)探索適合與芽孢桿菌聯(lián)合修復的其他生物類群，尤其是生長迅速、生物量大、耐受性強的重金屬富集植物。芽孢桿菌-植物聯(lián)合修復技術集合了芽孢桿菌修復與植物修復兩者的優(yōu)點。一方面，植物在生長過程中會向土壤分泌有機物，土壤根際微生物獲得來自植物的營養(yǎng)，種類更加豐富，代謝更加旺盛。另一方面，芽孢桿菌作為一種重要的促生菌，分解這類分泌物可產(chǎn)生有益的代謝產(chǎn)物，改變重金屬存在狀態(tài)，降低重金屬的植物毒性，促進植物對營養(yǎng)元素的吸收，從而增強植物宿主對重金屬的耐受性，促進植物的生長。

(3) 結合現(xiàn)代分子生物學與大數(shù)據(jù)分析技術，從分子領域深度研究芽孢桿菌修復機理，為實際工程應用提供理論支持。近年來高通量測序技術與基因組學興起，越來越多的芽孢桿菌全基因組測序完成，各種重金屬脅迫下基因表達組圖譜信息公布，都為微觀分子水平研究芽孢桿菌修復重金屬污染土壤提供了許多信息，科研人員應從各種組學的海量數(shù)據(jù)中發(fā)掘、整理和獲得有效信息，為基因工程菌株的構建或利用基因工程、合成生物學技術培育優(yōu)良菌株提供理論支持。此外，基因組學等為重金屬污染土壤修復研究提供了大量信息資源，為篩選重金屬抗性菌株提供了大量的選擇標記，研究人員應該以此為契機，探索開發(fā)高效率、高通量的抗性菌株篩選新技術。