胡學(xué)宇，楊小春，，薛 源，燕江波，周 永，金群華

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，銀川 750004）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種慢性退行性疾病，可累及關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨、半月板、滑膜及周圍軟組織[1]。其典型特征是關(guān)節(jié)軟骨退變，軟骨下骨骨重塑及滑膜炎性改變[2]。軟骨覆蓋于關(guān)節(jié)表面，起潤滑和支撐作用，主要由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）組成。軟骨細(xì)胞負(fù)責(zé)ECM成分的分泌和更新，ECM反過來對軟骨細(xì)胞起營養(yǎng)支持作用。當(dāng)軟骨由于磨損或機械應(yīng)力造成軟骨破壞，將會引起關(guān)節(jié)疼痛、腫脹及炎癥反應(yīng)[3]，ECM隨之丟失，其合成代謝和分解代謝的平衡被打破，造成骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT-1）作為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴性的Ⅲ類組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC），其對細(xì)胞生長、代謝、衰老及炎癥方面有重要作用[4]。在Wnt/β-catenin信號通路中，SIRT-1可發(fā)揮軟骨保護(hù)作用從而達(dá)到治療骨關(guān)節(jié)炎的作用[5]。淋巴細(xì)胞增強因子1（lymphoidenhancer factor，LEF-1）作為T細(xì)胞因子（TCF）/LEF家族中成員[6]，主要位于細(xì)胞核中，是Wnt信號通路中重要的調(diào)節(jié)因子。LEF-1參與調(diào)控多種疾病及代謝過程的發(fā)生[7-8]。β-catenin與LEF-1蛋白相互作用可穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)中β-catenin表達(dá)水平，在Wnt信號通路作用下，β-catenin被穩(wěn)定轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核內(nèi)，與LEF-1結(jié)合后，調(diào)控目的基因的表達(dá)。研究顯示[9]，β-catenin參與調(diào)節(jié)軟骨的保護(hù)，減輕關(guān)節(jié)軟骨的破壞與變性。為觀察在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生時，SIRT-1是否參與調(diào)節(jié)LEF-1蛋白的表達(dá)來發(fā)揮軟骨保護(hù)作用，進(jìn)行了本研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年2—7月寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院骨三科收治的原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎患者行全膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)后自愿捐贈的新鮮脛骨平臺組織，共30例，其中女性18例，男性12例，排除類風(fēng)濕、創(chuàng)傷等引起的繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎。所有實驗均獲得寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號-2020-999），并取得患者家屬的知情同意且符合赫爾辛基原則。

1.2 所用材料

組織固定液（索萊寶，北京）；番紅O固綠染料（索萊寶，北京）；伊紅染液試劑盒（索萊寶，北京）；PV-9001二抗試劑盒（中杉金橋，北京）；磷酸鹽緩沖液（中杉金橋，北京）；一抗：兔來源SIRT-1抗體（abcam，美國），兔來源β-catenin抗體（proteintech，武漢），兔來源LEF-1抗體（proteintech，武漢），兔來源CollagenⅡ抗體（abcam，美國），兔來源基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP-13）抗體（proteintech，武漢）；小量組織總RNA提取試劑盒（愛思進(jìn)，美國）；一步法cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（全式金，北京）；qPCR試劑盒（全式金，北京）；蘇木素染液（索萊寶，北京）；山羊抗兔IgG H&L（Alexa FluorR488）（abcam，美國）；抗熒光衰減封片劑（含DAPI）（碧云天，上海）。

1.3 組織處理及分組

將術(shù)中取下的新鮮標(biāo)本，用骨刀、咬骨鉗處理成1 cm×1 cm×0.5 cm大小，按照國際骨關(guān)節(jié)炎協(xié)會（Osteoarthritis Research Society International，OARSI）制定的評級評估標(biāo)本，評級為0～6級，分為OA輕度組（0～2級）、OA中度組（3～4級）、OA重度組（5～6級）[10]，每組樣本為30例。將新鮮標(biāo)本置于多聚甲醛液中固定48 h，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗6 h后置于10%EDTA脫鈣液中3周，每天換液1次。脫鈣結(jié)束后包埋，制成蠟塊標(biāo)本，將蠟塊切成5μm矢狀位切片，置于載玻片上烤干，進(jìn)行下一步實驗。

1.4 蘇木精-伊紅（HE）和番紅O固綠染色觀察人膝關(guān)節(jié)脛骨平臺軟骨組織病理改變

首先將烤干的組織切片置于二甲苯中脫蠟，并置于梯度酒精中脫水，沖洗干凈后，蘇木素染色3 min，鹽酸酒精分化5 s，自來水返藍(lán)10 min，然后0.2%固綠染色3 min，1%醋酸浸洗5 s，0.1%番紅染色3 min，最后二甲苯脫蠟，樹膠封片。在伊紅染色實驗中，首先將烤干的組織切片置于二甲苯中脫蠟，在梯度酒精中脫水后用蘇木素染色3 min并分化5 s，自來水返藍(lán)10 min后用伊紅染液染色2 min，最后樹膠封片。在100倍光鏡下觀察軟骨組織的病理改變和透明軟骨厚度和鈣化軟骨厚度，采用OARSI評級標(biāo)準(zhǔn)評估軟骨改變情況。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測脛骨軟骨組織中SIRT-1、β-catenin、LEF-1和CollagenⅡ的表達(dá)情況

將石蠟切片置于二甲苯中脫蠟，乙醇梯度脫水，于37℃下使用0.1%胰蛋白酶修復(fù)抗原15 min，3%過氧化氫液中孵育15 min，山羊血清封閉30 min，之后滴加一抗于4℃下過夜。所用一抗為Anti-SIRT-1:（abcam，1∶200），Anti-β-catenin:（proteintech，1∶200），Anti-LEF1:（proteintech，1∶200），Anti-Collagen II（abcam，1∶300）。最后選取脛骨平臺軟骨層區(qū)域并采用Image J 1.8.0軟件分析脛骨平臺組織中相應(yīng)蛋白的陽性細(xì)胞面積百分比。

1.6 免疫熒光實驗檢測不同分組人膝關(guān)節(jié)脛骨軟骨組織中LEF-1和MMP-13的表達(dá)情況

對于免疫熒光實驗，將切片置于二甲苯中脫蠟，梯度脫水，抗原修復(fù)并山羊血清封閉后與相應(yīng)一抗在4℃下過夜。并與Alexa Fluor 488山羊抗兔二抗（Abcam，1∶300，ab150077）結(jié)合于37℃孵育60 min。使用倒置熒光顯微鏡觀察陽性細(xì)胞，并用Image Pro-Plus 6.0軟件選取軟骨層區(qū)域，計數(shù)不同組別相應(yīng)蛋白的陽性細(xì)胞平均吸光度（IOD）情況，使用GraphPad Prism 8.3.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。

1.7 qPCR實驗檢測不同分組人脛骨軟骨中SIRT-1和LEF-1的mRNA表達(dá)變化

根據(jù)2009年發(fā)布的實時定量PCR（MIQE）指南規(guī)定的信息進(jìn)qPCR反應(yīng)，使用組織RNA提取試劑盒（AXYGEN，Wujiang，China）提取人膝關(guān)節(jié)脛骨軟骨中總RNA，使用總RNA（500 ng）制備cDNA（Bio-rad，Hercules，CA，USA），25 ng的cDNA和Syber Green的混合物（Transgen Biotech，Beijing，China）進(jìn)行實時定量PCR反應(yīng)。

使用的引物序列為：β-actin forward（F）為5'-GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG-3'，Reve rse（R）為5'-ATGCCACAGGATTCCATACC-3'；SIRT-1（F）為5'-AACAGGTTGCGGGAATCCAAAGG-3'，R為5'-AGCTGGGCACCTAGGACATCG-3'；LEF-1（F）為5'-CACACAACTGGCATCCCTCATCC-3'，R為5'-GGCTCCTGCTCCTTTCTCTGTTC-3'；βactin作為參考基因。使用2-△△CT計算目的基因相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad Prism 8.3.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，本研究數(shù)據(jù)滿足方差齊性要求，計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組人脛骨平臺軟骨組織退變程度比較

番紅O固綠和HE染色結(jié)果顯示：相對OA輕度組，OA重度組標(biāo)本軟骨大量丟失，軟骨下骨暴露；而OA中度組軟骨中度磨損，可見部分軟骨細(xì)胞細(xì)胞核丟失，軟骨細(xì)胞肥大，部分壞死，透明軟骨變薄。與OA輕度組相比較，OA重度組的OARSI評分升高，OA中度組介于兩者之間，見圖1。三組人脛骨平臺軟骨組織的透明軟骨厚度、鈣化軟骨厚度和OARSI評分差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01）；透明軟骨厚度：OA輕度組＞中度組＞重度組（P均＜0.01）；鈣化軟骨厚度和OARSI評分：OA輕度組＜中度組＜重度組（P均＜0.01），見表1。

2.2 不同組脛骨軟骨組織中SIRT-1、LEF-1、βcatenin和CollagenⅡ蛋白相對表達(dá)量比較

免疫組化結(jié)果顯示：三組脛骨軟骨組織中SIRT-1、LEF-1、β-catenin和CollagenⅡ蛋白相對表達(dá)量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01），見圖2、圖3。；SIRT-1和CollagenⅡ蛋白表達(dá)量OA中度和重度組低于OA輕度組，OA中度組低于重度組（P均＜0.01）；LEF-1和β-catenin蛋白的表達(dá)量OA中度和重度組高于OA輕度組，OA重度組高于中度組（P均＜0.01），見表2。

2.3 不同分組中LEF-1和MMP-13蛋白表達(dá)變化的比較

免疫熒光結(jié)果顯示：三組人脛骨軟骨組織中LEF-1和MMP-13蛋白相對表達(dá)量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01）；LEF-1和MMP-13蛋白表達(dá)量OA中度和重度組低于OA輕度組，OA中度組低于重度組（P均＜0.01），見圖4、表3。

圖1 人膝關(guān)節(jié)脛骨平臺軟骨組織病理改變

表1 不同組人脛骨平臺軟骨組織退變程度比較（±s）

表1 不同組人脛骨平臺軟骨組織退變程度比較（±s）

與OA輕度組相比*P＜0.01；與OA中度組相比#P＜0.01。

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表2 OA各組軟骨各蛋白表達(dá)量比較（±s）

表2 OA各組軟骨各蛋白表達(dá)量比較（±s）

與OA輕度組相比*P＜0.01；與OA中度組相比#P＜0.01。

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圖2 人膝關(guān)節(jié)脛骨平臺軟骨組織中SIRT-1和LEF-1蛋白表達(dá)變化情況（免疫組織化學(xué)×100）

圖3 人膝關(guān)節(jié)脛骨平臺軟骨組織中β-catenin和CollagenⅡ蛋白表達(dá)變化情況（免疫組織化學(xué)×100）

表3 OA各組中軟骨各蛋白表達(dá)量分析（±s）

表3 OA各組中軟骨各蛋白表達(dá)量分析（±s）

與OA輕度組相比*P＜0.01；與OA中度組相比#P＜0.01。

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2.4 不同分組中SIRT-1和LEF-1的mRNA相對表達(dá)情況

qPCR實驗結(jié)果顯示：三組人脛骨軟骨組織中SIRT-1和LEF-1的mRNA相對表達(dá)量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01）；SIRT-1和LEF-1的mRNA表達(dá)量OA中度和重度組低于OA輕度組，OA中度組低于重度組（P均＜0.01），見圖5。

3 討論

本研究結(jié)果表明，在OA發(fā)展過程中，軟骨面逐漸破壞受損，軟骨細(xì)胞肥大壞死，透明軟骨厚度逐漸被磨損變薄，與之相反，鈣化軟骨厚度逐漸增加，重度組標(biāo)本軟骨面缺損，軟骨下骨暴露，部分標(biāo)本透明軟骨消失，OARSI評級升高。這也驗證了在臨床上OA患者表現(xiàn)出的軟骨磨損，活動時出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛現(xiàn)象。本研究依據(jù)OARSI分級原則，將相應(yīng)病理染色切片組織分成了OA輕度組，OA中度組和OA重度組。在不同組中測得不同蛋白的表達(dá)水平不同。

免疫組織化學(xué)實驗結(jié)果顯示SIRT-1蛋白的表達(dá)量隨著軟骨破壞程度增加其表達(dá)逐漸減少，提示其表達(dá)變化可能與OA的發(fā)生發(fā)展有關(guān)；另外，在SIRT-1表達(dá)減少的同時，LEF-1和βcatenin蛋白的表達(dá)趨勢與之相反，表達(dá)量逐漸增加。這些與之前的研究結(jié)果相一致[11]，同時qPCR實驗結(jié)果也證實了這一點，提示SIRT-1可能具有LEF-1的調(diào)節(jié)作用。二型膠原是軟骨細(xì)胞ECM中主要的膠原，起營養(yǎng)、支撐、保護(hù)軟骨細(xì)胞的作用[12]。在本實驗中可以看到，隨著軟骨破壞的增加，二型膠原mRNA的表達(dá)逐漸減少，這也證實二型膠原與軟骨破壞丟失有著密切聯(lián)系。

圖4 人膝關(guān)節(jié)脛骨平臺軟骨組織中β-catenin和CollagenⅡ蛋白表達(dá)情況（免疫熒光×200）

圖5 不同分組人脛骨軟骨組織中SIRT-1和LEF-1的mRNA相對表達(dá)情況

MMP-13作為軟骨中二型膠原的主要降解酶，在OA中起重要作用[13]。在免疫熒光實驗中，結(jié)果顯示，LEF-1和MMP-13的蛋白表達(dá)量隨著軟骨破壞程度的增加而增加，提示在OA時，LEF-1和MMP-13可能存在協(xié)同作用，這也和免疫組化實驗中二型膠原蛋白的表達(dá)變化相符合。結(jié)合之前研究結(jié)果推測，SIRT-1可能也具有調(diào)節(jié)MMP-13蛋白表達(dá)變化的作用。

SIRT-1表達(dá)于所有軟骨和滑膜組織的細(xì)胞核中，其去乙酰化能力與多種炎癥及疾病發(fā)生有關(guān)[14]。SIRT-1能調(diào)節(jié)機體的代謝功能，調(diào)節(jié)生物體胰島素敏感性，是控制炎癥的關(guān)鍵因子[15]。在缺乏SIRT-1基因小鼠的軟骨中發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞凋亡增加，ECM中二型膠原表達(dá)明顯減少，與之相反，聚集金屬基質(zhì)蛋白酶13（MMP-13）表達(dá)明顯增加[16]。本文免疫組織化學(xué)研究結(jié)果也進(jìn)一步證明了這些觀點。SIRT-1能激活人軟骨細(xì)胞中的自噬，發(fā)揮軟骨保護(hù)功能[17]。另外SIRT-1還參與了急性腎損傷、顱腦外傷、主動脈硬化等疾病的發(fā)病過程[18]，這些疾病中SIRT-1的表達(dá)水平降低，而在一些癌癥中觀察到SIRT-1表達(dá)水平顯著升高[19]，提示其也許可以用于癌癥治療。伏立諾他（SAHA）作為一種天然的HDAC抑制劑被證明可以抑制IL-1β誘導(dǎo)的MMP-13表達(dá)[20]。同樣作為天然HDAC抑制劑，曲古抑菌素（TSA）可以提高OA小鼠基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物（TIMP-1）/MMP比率發(fā)揮軟骨保護(hù)作用[21]。這些研究表明HDAC抑制劑在OA中也發(fā)揮著保護(hù)作用，也許是另一個不錯的研究方向。