劉 圓,張 輝,馬勝超,李桂忠,姜怡鄧
(寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,寧夏血管損傷與修復(fù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國家衛(wèi)健委代謝性心血管疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,銀川 750004)
動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)[1]是一種發(fā)生于大中型動(dòng)脈的慢性疾病,是各類缺血性心腦血管疾病的病理學(xué)基礎(chǔ),其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜,目前存在多種假說,內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙作為As發(fā)病的初始和必要步驟獲得大多數(shù)學(xué)者認(rèn)可。同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)是體內(nèi)蛋氨酸代謝過程中形成的一種含硫氨基酸,屬于蛋氨酸循環(huán)的中間產(chǎn)物[2]。本課題組前期研究[3]表明,Hcy可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,但其具體機(jī)制尚不明確。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)[4]是一類長度超過200 nt,無編碼能力的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。lncRNA可以在表觀遺傳修飾水平、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平等多個(gè)層次調(diào)控基因表達(dá)[5-6],從而在細(xì)胞分化、增殖、凋亡、遷移和多能干細(xì)胞再生等多個(gè)生理過程中起到重要作用。lncRNA DINO作為lncRNA的一員,在癌細(xì)胞的遷移、凋亡[7]中發(fā)揮重要作用,但其在Hcy致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用尚不明確。本文旨在明確lncRNA DINO在Hcy誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用,為As的治療提供理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)(中國,名勁生物技術(shù)有限公司);Hcy(美國,Sigma公司);胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(澳大利亞,Gibco公司);青鏈霉素、胰蛋白酶消化液、NP-40(中國,碧云天生物技術(shù)研究所);細(xì)胞活力熒光測定試劑盒(瑞士,Roche公司);苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制劑(中國,北京索萊寶科技有限公司);Bax抗體、Bcl-2抗體(英國,Abcam公司);β-actin抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(中國,北京金橋有限公司);脫脂奶粉(美國,BD公司);cDNA試劑盒、RTqPCR試劑盒(日本,Takara公司);Lipo2000(美國,Thermo Fisher公司);Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海,Best bio公司);引物由上海生工有限公司合成;lncRNA DINOsiRNA、si-NC由湖州河馬科技有限公司構(gòu)建。
超凈工作臺(蘇州,安泰);CO2培養(yǎng)箱(德國,Heraeus公司);5415D型微量臺式離心機(jī)(德國,Eppendorf公司);超微量分光光度計(jì)(美國,SimpliNano公司);垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、曝光儀(美國,Bio-Rad公司);BS110S型精密天平(德國,Sartorius公司);水平搖床(美國,Thermo Fisher公司);梯度RCR儀(德國,Biometra Tone公司);熒光定量PCR儀(上海,楓嶺);ACEA NovoCyte流式細(xì)胞儀(美國,艾森);激光共聚焦顯微鏡(德國,ZEISS)。
1.3.1 HUVECs細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVECs,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中,待細(xì)胞密度達(dá)70%左右時(shí),用終濃度0μmol·L-1Hcy(對照組)、100μmol·L-1Hcy(實(shí)驗(yàn)組)干預(yù)細(xì)胞72 h后,收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.3.2 MTT法檢測Hcy作用于HUVECs細(xì)胞的最適濃度 將HUVECs細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24 h棄上清,將含不同濃度Hcy(0、50、100、200和500μmol·L-1)的細(xì)胞培養(yǎng)液按照100μL/孔加入培養(yǎng)板中,每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,37℃、5%CO2培養(yǎng)72 h后,MTT法測細(xì)胞存活率(按照說明書操作)。
1.3.3 細(xì)胞活力染色檢測HUVECs細(xì)胞凋亡情況 棄去培養(yǎng)基,將激光共聚焦皿中的細(xì)胞用PBS清洗3次,在15 mL離心管中加入5 mL PBS,5μL Nuclei Dye、25μL Dead Dye、3μL Viable Dye,將3種染料混合后,在每個(gè)培養(yǎng)皿中依次加入200μL混合染料,于37℃孵育30 min后取出,激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況。
1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測HUVECs細(xì)胞凋亡情況 使用不含EDTA、不含酚紅的胰酶消化內(nèi)皮細(xì)胞,800 r·min-1、4℃離心10 min棄上清。冷PBS洗滌細(xì)胞3次后,用800μL 1×Annexin V結(jié)合液重懸細(xì)胞,加入5μL Annexin V-FITC染色液,混勻,4℃避光孵育15 min,加入5μL PI染色液后混勻,避光孵育5 min,立即置于流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡改變。
1.3.5 RT-qPCR檢測各組HUVECs細(xì)胞中l(wèi)ncRNA DINO表達(dá) 按Takara RNA試劑盒的說明書操作提取各組細(xì)胞總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR擴(kuò)增程序:95℃30 s;95℃5 s;60℃34 s,共40個(gè)循環(huán),并設(shè)內(nèi)參(GADPH)對照同體系擴(kuò)增。目的基因的相對量以2-△△Ct表示。引物序列見表1。
表1 lncRNA DINO及GAPDH的引物序列
1.3.6 lncRNA DINO干擾片段轉(zhuǎn)染HUVECs細(xì)胞 將HUVECs細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)24 h,細(xì)胞密度達(dá)70%,嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000試劑盒操作說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作,分別將5μL陰性對照si-NC和si-DINO加入250μL無血清培養(yǎng)基,輕柔混勻,將6μL Lipofectamine TM2000脂質(zhì)體與250μL無血清培養(yǎng)基混勻,室溫放置5 min。5 min后,兩者混勻,室溫放置20 min。6孔板中每孔用不含血清的培養(yǎng)基定容至2 mL,放入恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),轉(zhuǎn)染6 h后對照組更換7%DMEN培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)組更換含100μmoL·L-1Hcy的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h。
1.3.7 Western blot測定HUVECs中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) PMSF與NP-40裂解液按1∶100配制蛋白裂解液,依據(jù)細(xì)胞量加入裂解液,置于搖床,4℃,30 min后,12000 r·min-1、4℃離心20 min,轉(zhuǎn)移蛋白上清液至新的EP管中,按照蛋白與緩沖液4∶1的比例,加入上樣緩沖液,99℃煮沸變性5 min。每孔300μg蛋白樣品,SDS-PAGE電泳,將膠轉(zhuǎn)印至0.22μm PVDF膜上,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,PBST洗膜10 min,共3次,分別加入β-actin抗體(1∶10000)、Bax、Bcl-2抗體(1∶2000),4℃過夜,PBST室溫洗膜10 min,重復(fù)3次,用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5000)室溫孵育2 h后,PBST室溫洗膜10 min,重復(fù)3次,曝光。以Bax、Bcl-2與β-actin的光密度值比值作為Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的相對量。
本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料,采用Prism 7.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn),多樣本均數(shù)間比較采用one-way ANOVA檢驗(yàn),組間兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn),P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
MTT法檢測不同濃度0、50、100、200和500 μmol·L-1Hcy對內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響,結(jié)果顯示:隨著Hcy濃度的增加,內(nèi)皮細(xì)胞存活率逐漸降低,呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系,100、200和500μmol·L-1內(nèi)皮細(xì)胞存活率均下降(P均<0.001),50μmol·L-1Hcy內(nèi)皮細(xì)胞存活率相較于對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖1。
圖1 MTT法檢測Hcy作用于HUVECs細(xì)胞的最適濃度
細(xì)胞活力染色檢測Hcy對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響,用激光共聚焦顯微鏡觀察,結(jié)果顯示:與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞數(shù)(紅色細(xì)胞數(shù))增加,細(xì)胞活力降低,見圖2。
圖2 HUVECs細(xì)胞凋亡情況(細(xì)胞活力染色×100)
流式細(xì)胞術(shù)分析Hcy干預(yù)后內(nèi)皮細(xì)胞凋亡水平變化,結(jié)果顯示:與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組內(nèi)皮細(xì)胞凋亡水平增加(P<0.01),見圖3。
圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測Hcy對HUVECs細(xì)胞凋亡的影響
RT-qPCR檢測HUVECs細(xì)胞lncRNA DINO的表達(dá),結(jié)果顯示:與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組lncRNA DINO表達(dá)增加(P<0.01),見圖4。
圖4 RT-qPCR檢測Hcy對HUVECs細(xì)胞lncRNA DINO表達(dá)的影響
轉(zhuǎn)染si-DINO后,RT-qPCR檢測HUVECs細(xì)胞的lncRNA DINO表達(dá),結(jié)果顯示:與si-NC組相比,si-DINO組的lncRNA DINO表達(dá)降低(P<0.01),見圖5。
圖5 RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染lncRNA DINO干擾片段后HUVECs細(xì)胞的lncRNA DINO表達(dá)
為進(jìn)一步明確lncRNA DINO對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響,細(xì)胞活力染色檢測Hcy作用于轉(zhuǎn)染si-DINO后的HUVECs細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果顯示:Hcy干預(yù)后,與Hcy-NC組相比,Hcy-si組紅色細(xì)胞數(shù)目明顯減少,見圖6。
圖6 Hcy對轉(zhuǎn)染lncRNA DINO干擾片段的HUVECs細(xì)胞凋亡的影響(細(xì)胞活力染色×100)
流式細(xì)胞術(shù)檢測Hcy作用于轉(zhuǎn)染si-DINO后的HUVECs的細(xì)胞凋亡水平,結(jié)果顯示:Hcy干預(yù)后,與Hcy-NC組相比,Hcy-si組內(nèi)皮細(xì)胞凋亡水平下降(P<0.01),見圖7。
Western blot檢測Hcy作用于轉(zhuǎn)染lncRNA DINO干擾片段的HUVECs的細(xì)胞Bax、Bcl-2表達(dá),結(jié)果顯示:Hcy干預(yù)后,與Hcy-NC組相比,Hcy-si組中Bax、Bcl-2表達(dá)下降(P<0.01),見圖8。
圖7 Hcy對轉(zhuǎn)染lncRNA DINO干擾片段的HUVECs細(xì)胞凋亡的影響
圖8 Hcy對轉(zhuǎn)染lncRNA DINO干擾片段的HUVECs的細(xì)胞Bax、Bcl-2表達(dá)
As是一種以內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、平滑肌細(xì)胞增殖、泡沫細(xì)胞形成為主要特征的慢性進(jìn)行性疾病,是造成世界范圍內(nèi)心腦血管疾病高發(fā)病率和病死率的主要原因[8]。在As的發(fā)病機(jī)制中,內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙作為始動(dòng)環(huán)節(jié)起著至關(guān)重要的作用[9]。在引起內(nèi)皮功能障礙的諸多因素中,內(nèi)皮細(xì)胞凋亡受到了廣泛關(guān)注[10-11]。Hcy是體內(nèi)蛋氨酸代謝循環(huán)中形成的一種含硫氨基酸,各種臨床實(shí)驗(yàn)及流行病學(xué)研究表明,其是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子[12]。研究[13-14]發(fā)現(xiàn),高同型半胱氨酸可下調(diào)Bcl-2 mRNA及蛋白的表達(dá),促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,加速As的發(fā)生發(fā)展,增加葉酸和VB12可減少高同型半胱氨酸所致的細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中通過MTT法檢測Hcy對內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響,選擇最適濃度為100μmol·L-1,干預(yù)細(xì)胞后,細(xì)胞活力染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞數(shù)增加,進(jìn)一步證實(shí)了Hcy對內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡作用,但對Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制尚不明確。
lncRNA作為一種長度大于200個(gè)核苷酸的RNA分子[15-16],可分為正義型、反義型、雙向型、內(nèi)含子區(qū)和基因間5大類[17]。lncRNA不編碼蛋白質(zhì),缺乏開放閱讀框,曾被誤以為是RNA界的“噪音”,不具有生物學(xué)功能。但近來研究發(fā)現(xiàn),lncRNA是一類新興的基因表達(dá)調(diào)控子,其參與基因的表觀調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等,從而在多種生物學(xué)過程中如細(xì)胞的增長[18]、細(xì)胞周期的調(diào)控[19]、凋亡[20]、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移等發(fā)揮關(guān)鍵的作用。lncRNA DINO是新近發(fā)現(xiàn)的一種新型lncRNA,其廣泛參與癌癥發(fā)展機(jī)制,有文獻(xiàn)報(bào)道lncRNA DINO通過重新激活抑癌基因TP53的表達(dá)抑制宮頸癌的轉(zhuǎn)移[21];也有文獻(xiàn)報(bào)道其可抑制胃癌細(xì)胞的凋亡率,在胃癌進(jìn)展中發(fā)揮抑瘤作用[22],但在Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用暫無報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)Hcy干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞lncRNA DINO表達(dá)增加,為進(jìn)一步明確其作用,轉(zhuǎn)染lncRNA DINO干擾片段后,細(xì)胞活力染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示,si-DINO組細(xì)胞凋亡數(shù)較si-NC組凋亡數(shù)明顯減少,且Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)下降,提示lncRNA DINO能夠促進(jìn)Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。
綜上所述,我們以HUVECs的凋亡為研究切入點(diǎn),旨在探討lncRNA DINO在Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,lncRNA DINO能夠促進(jìn)Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。因此,繼續(xù)深入探討lncRNA DINO在Hcy誘導(dǎo)的HUVECs凋亡調(diào)控機(jī)制,將有望為As的防治尋找新的靶點(diǎn)。