劉 圓，張 輝，馬勝超，李桂忠，姜怡鄧

（寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，寧夏血管損傷與修復(fù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家衛(wèi)健委代謝性心血管疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，As）[1]是一種發(fā)生于大中型動(dòng)脈的慢性疾病，是各類缺血性心腦血管疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)，其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，目前存在多種假說，內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙作為As發(fā)病的初始和必要步驟獲得大多數(shù)學(xué)者認(rèn)可。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是體內(nèi)蛋氨酸代謝過程中形成的一種含硫氨基酸，屬于蛋氨酸循環(huán)的中間產(chǎn)物[2]。本課題組前期研究[3]表明，Hcy可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，但其具體機(jī)制尚不明確。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）[4]是一類長度超過200 nt，無編碼能力的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。lncRNA可以在表觀遺傳修飾水平、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平等多個(gè)層次調(diào)控基因表達(dá)[5-6]，從而在細(xì)胞分化、增殖、凋亡、遷移和多能干細(xì)胞再生等多個(gè)生理過程中起到重要作用。lncRNA DINO作為lncRNA的一員，在癌細(xì)胞的遷移、凋亡[7]中發(fā)揮重要作用，但其在Hcy致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用尚不明確。本文旨在明確lncRNA DINO在Hcy誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用，為As的治療提供理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）（中國，名勁生物技術(shù)有限公司）；Hcy（美國，Sigma公司）；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（澳大利亞，Gibco公司）；青鏈霉素、胰蛋白酶消化液、NP-40（中國，碧云天生物技術(shù)研究所）；細(xì)胞活力熒光測定試劑盒（瑞士，Roche公司）；苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制劑（中國，北京索萊寶科技有限公司）；Bax抗體、Bcl-2抗體（英國，Abcam公司）；β-actin抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（中國，北京金橋有限公司）；脫脂奶粉（美國，BD公司）；cDNA試劑盒、RTqPCR試劑盒（日本，Takara公司）；Lipo2000（美國，Thermo Fisher公司）；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海，Best bio公司）；引物由上海生工有限公司合成；lncRNA DINOsiRNA、si-NC由湖州河馬科技有限公司構(gòu)建。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺（蘇州，安泰）；CO2培養(yǎng)箱（德國，Heraeus公司）；5415D型微量臺式離心機(jī)（德國，Eppendorf公司）；超微量分光光度計(jì)（美國，SimpliNano公司）；垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、曝光儀（美國，Bio-Rad公司）；BS110S型精密天平（德國，Sartorius公司）；水平搖床（美國，Thermo Fisher公司）；梯度RCR儀（德國，Biometra Tone公司）；熒光定量PCR儀（上海，楓嶺）；ACEA NovoCyte流式細(xì)胞儀（美國，艾森）；激光共聚焦顯微鏡（德國，ZEISS）。

1.3 方法

1.3.1 HUVECs細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVECs，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞密度達(dá)70%左右時(shí)，用終濃度0μmol·L-1Hcy（對照組）、100μmol·L-1Hcy（實(shí)驗(yàn)組）干預(yù)細(xì)胞72 h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 MTT法檢測Hcy作用于HUVECs細(xì)胞的最適濃度 將HUVECs細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h棄上清，將含不同濃度Hcy（0、50、100、200和500μmol·L-1）的細(xì)胞培養(yǎng)液按照100μL/孔加入培養(yǎng)板中，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)72 h后，MTT法測細(xì)胞存活率（按照說明書操作）。

1.3.3 細(xì)胞活力染色檢測HUVECs細(xì)胞凋亡情況 棄去培養(yǎng)基，將激光共聚焦皿中的細(xì)胞用PBS清洗3次，在15 mL離心管中加入5 mL PBS，5μL Nuclei Dye、25μL Dead Dye、3μL Viable Dye，將3種染料混合后，在每個(gè)培養(yǎng)皿中依次加入200μL混合染料，于37℃孵育30 min后取出，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測HUVECs細(xì)胞凋亡情況 使用不含EDTA、不含酚紅的胰酶消化內(nèi)皮細(xì)胞，800 r·min-1、4℃離心10 min棄上清。冷PBS洗滌細(xì)胞3次后，用800μL 1×Annexin V結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入5μL Annexin V-FITC染色液，混勻，4℃避光孵育15 min，加入5μL PI染色液后混勻，避光孵育5 min，立即置于流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡改變。

1.3.5 RT-qPCR檢測各組HUVECs細(xì)胞中l(wèi)ncRNA DINO表達(dá) 按Takara RNA試劑盒的說明書操作提取各組細(xì)胞總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR擴(kuò)增程序：95℃30 s；95℃5 s；60℃34 s，共40個(gè)循環(huán)，并設(shè)內(nèi)參（GADPH）對照同體系擴(kuò)增。目的基因的相對量以2-△△Ct表示。引物序列見表1。

表1 lncRNA DINO及GAPDH的引物序列

1.3.6 lncRNA DINO干擾片段轉(zhuǎn)染HUVECs細(xì)胞 將HUVECs細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞密度達(dá)70%，嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000試劑盒操作說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，分別將5μL陰性對照si-NC和si-DINO加入250μL無血清培養(yǎng)基，輕柔混勻，將6μL Lipofectamine TM2000脂質(zhì)體與250μL無血清培養(yǎng)基混勻，室溫放置5 min。5 min后，兩者混勻，室溫放置20 min。6孔板中每孔用不含血清的培養(yǎng)基定容至2 mL，放入恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染6 h后對照組更換7%DMEN培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組更換含100μmoL·L-1Hcy的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.3.7 Western blot測定HUVECs中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) PMSF與NP-40裂解液按1∶100配制蛋白裂解液，依據(jù)細(xì)胞量加入裂解液，置于搖床，4℃，30 min后，12000 r·min-1、4℃離心20 min，轉(zhuǎn)移蛋白上清液至新的EP管中，按照蛋白與緩沖液4∶1的比例，加入上樣緩沖液，99℃煮沸變性5 min。每孔300μg蛋白樣品，SDS-PAGE電泳，將膠轉(zhuǎn)印至0.22μm PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，PBST洗膜10 min，共3次，分別加入β-actin抗體（1∶10000）、Bax、Bcl-2抗體（1∶2000），4℃過夜，PBST室溫洗膜10 min，重復(fù)3次，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5000）室溫孵育2 h后，PBST室溫洗膜10 min，重復(fù)3次，曝光。以Bax、Bcl-2與β-actin的光密度值比值作為Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的相對量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，采用Prism 7.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)間比較采用one-way ANOVA檢驗(yàn)，組間兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測Hcy作用于HUVECs細(xì)胞的最適濃度

MTT法檢測不同濃度0、50、100、200和500 μmol·L-1Hcy對內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果顯示：隨著Hcy濃度的增加，內(nèi)皮細(xì)胞存活率逐漸降低，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，100、200和500μmol·L-1內(nèi)皮細(xì)胞存活率均下降（P均＜0.001），50μmol·L-1Hcy內(nèi)皮細(xì)胞存活率相較于對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 MTT法檢測Hcy作用于HUVECs細(xì)胞的最適濃度

2.2 細(xì)胞活力染色檢測Hcy對HUVECs細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞活力染色檢測Hcy對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響，用激光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果顯示：與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞數(shù)（紅色細(xì)胞數(shù)）增加，細(xì)胞活力降低，見圖2。

圖2 HUVECs細(xì)胞凋亡情況（細(xì)胞活力染色×100）

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測Hcy對HUVECs細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)分析Hcy干預(yù)后內(nèi)皮細(xì)胞凋亡水平變化，結(jié)果顯示：與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組內(nèi)皮細(xì)胞凋亡水平增加（P＜0.01），見圖3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測Hcy對HUVECs細(xì)胞凋亡的影響

2.4 RT-qPCR檢測Hcy對HUVECs細(xì)胞lncRNA DINO表達(dá)的影響

RT-qPCR檢測HUVECs細(xì)胞lncRNA DINO的表達(dá)，結(jié)果顯示：與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組lncRNA DINO表達(dá)增加（P＜0.01），見圖4。

圖4 RT-qPCR檢測Hcy對HUVECs細(xì)胞lncRNA DINO表達(dá)的影響

2.5 RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染lncRNA DINO干擾片段后HUVECs細(xì)胞的lncRNA DINO表達(dá)

轉(zhuǎn)染si-DINO后，RT-qPCR檢測HUVECs細(xì)胞的lncRNA DINO表達(dá)，結(jié)果顯示：與si-NC組相比，si-DINO組的lncRNA DINO表達(dá)降低（P＜0.01），見圖5。

圖5 RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染lncRNA DINO干擾片段后HUVECs細(xì)胞的lncRNA DINO表達(dá)

2.6 細(xì)胞活力染色檢測Hcy對轉(zhuǎn)染lncRNA DINO干擾片段的HUVECs的細(xì)胞凋亡的影響

為進(jìn)一步明確lncRNA DINO對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響，細(xì)胞活力染色檢測Hcy作用于轉(zhuǎn)染si-DINO后的HUVECs細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示：Hcy干預(yù)后，與Hcy-NC組相比，Hcy-si組紅色細(xì)胞數(shù)目明顯減少，見圖6。

圖6 Hcy對轉(zhuǎn)染lncRNA DINO干擾片段的HUVECs細(xì)胞凋亡的影響（細(xì)胞活力染色×100）

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測Hcy對轉(zhuǎn)染lncRNA DINO干擾片段的HUVECs細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測Hcy作用于轉(zhuǎn)染si-DINO后的HUVECs的細(xì)胞凋亡水平，結(jié)果顯示：Hcy干預(yù)后，與Hcy-NC組相比，Hcy-si組內(nèi)皮細(xì)胞凋亡水平下降（P＜0.01），見圖7。

2.8 Western blot檢測Hcy對轉(zhuǎn)染lncRNA DINO干擾片段的HUVECs的細(xì)胞Bax、Bcl-2的表達(dá)

Western blot檢測Hcy作用于轉(zhuǎn)染lncRNA DINO干擾片段的HUVECs的細(xì)胞Bax、Bcl-2表達(dá)，結(jié)果顯示：Hcy干預(yù)后，與Hcy-NC組相比，Hcy-si組中Bax、Bcl-2表達(dá)下降（P＜0.01），見圖8。

3 討論

圖7 Hcy對轉(zhuǎn)染lncRNA DINO干擾片段的HUVECs細(xì)胞凋亡的影響

圖8 Hcy對轉(zhuǎn)染lncRNA DINO干擾片段的HUVECs的細(xì)胞Bax、Bcl-2表達(dá)

As是一種以內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、平滑肌細(xì)胞增殖、泡沫細(xì)胞形成為主要特征的慢性進(jìn)行性疾病，是造成世界范圍內(nèi)心腦血管疾病高發(fā)病率和病死率的主要原因[8]。在As的發(fā)病機(jī)制中，內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙作為始動(dòng)環(huán)節(jié)起著至關(guān)重要的作用[9]。在引起內(nèi)皮功能障礙的諸多因素中，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡受到了廣泛關(guān)注[10-11]。Hcy是體內(nèi)蛋氨酸代謝循環(huán)中形成的一種含硫氨基酸，各種臨床實(shí)驗(yàn)及流行病學(xué)研究表明，其是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子[12]。研究[13-14]發(fā)現(xiàn)，高同型半胱氨酸可下調(diào)Bcl-2 mRNA及蛋白的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，加速As的發(fā)生發(fā)展，增加葉酸和VB12可減少高同型半胱氨酸所致的細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中通過MTT法檢測Hcy對內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響，選擇最適濃度為100μmol·L-1，干預(yù)細(xì)胞后，細(xì)胞活力染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞數(shù)增加，進(jìn)一步證實(shí)了Hcy對內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡作用，但對Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制尚不明確。

lncRNA作為一種長度大于200個(gè)核苷酸的RNA分子[15-16]，可分為正義型、反義型、雙向型、內(nèi)含子區(qū)和基因間5大類[17]。lncRNA不編碼蛋白質(zhì)，缺乏開放閱讀框，曾被誤以為是RNA界的“噪音”，不具有生物學(xué)功能。但近來研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA是一類新興的基因表達(dá)調(diào)控子，其參與基因的表觀調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等，從而在多種生物學(xué)過程中如細(xì)胞的增長[18]、細(xì)胞周期的調(diào)控[19]、凋亡[20]、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移等發(fā)揮關(guān)鍵的作用。lncRNA DINO是新近發(fā)現(xiàn)的一種新型lncRNA，其廣泛參與癌癥發(fā)展機(jī)制，有文獻(xiàn)報(bào)道lncRNA DINO通過重新激活抑癌基因TP53的表達(dá)抑制宮頸癌的轉(zhuǎn)移[21]；也有文獻(xiàn)報(bào)道其可抑制胃癌細(xì)胞的凋亡率，在胃癌進(jìn)展中發(fā)揮抑瘤作用[22]，但在Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用暫無報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)Hcy干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞lncRNA DINO表達(dá)增加，為進(jìn)一步明確其作用，轉(zhuǎn)染lncRNA DINO干擾片段后，細(xì)胞活力染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，si-DINO組細(xì)胞凋亡數(shù)較si-NC組凋亡數(shù)明顯減少，且Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)下降，提示lncRNA DINO能夠促進(jìn)Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

綜上所述，我們以HUVECs的凋亡為研究切入點(diǎn)，旨在探討lncRNA DINO在Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，lncRNA DINO能夠促進(jìn)Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。因此，繼續(xù)深入探討lncRNA DINO在Hcy誘導(dǎo)的HUVECs凋亡調(diào)控機(jī)制，將有望為As的防治尋找新的靶點(diǎn)。