趙 帥，陳冬梅，2，虎 娜，楊張杰，王宇欣，馬會(huì)明

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院干細(xì)胞研究所，銀川 750004）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡期女性最為常見的內(nèi)分泌紊亂和代謝異常性疾病之一，育齡婦女發(fā)病率6%～21%，是女性不孕的主要原因之一[1]。PCOS中顆粒細(xì)胞增殖和凋亡異常以及顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞間的縫隙連接或旁分泌通訊功能受限，都會(huì)導(dǎo)致PCOS卵泡發(fā)育障礙，并影響排卵和黃體生成。有文獻(xiàn)報(bào)道[2]，卵巢顆粒細(xì)胞增殖和凋亡在促進(jìn)卵泡發(fā)育功能、卵母細(xì)胞的成熟以及合成和分泌卵泡抑制素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、雌激素和黃體生成素（luteinizing hormone，LH）等方面均具有重要作用。因此，增強(qiáng)卵巢顆粒細(xì)胞的增殖能力、降低凋亡率的作用可改善卵母細(xì)胞生長和成熟的微環(huán)境，同時(shí)也為卵母細(xì)胞的生長、發(fā)育、募集以及排卵過程提供營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而改善PCOS的卵巢功能。

β-谷甾醇（β-sitosterol）是一種天然多酚羥酸類化合物，屬于甾醇類成分中的主要成分之一，β-谷甾醇通過多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮抗氧化、抗炎、抗凋亡和神經(jīng)保護(hù)等生物學(xué)活性[3]。β-谷甾醇可通過增加癌細(xì)胞凋亡來抑制肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌，在人白血病細(xì)胞中表現(xiàn)出顯著的抗誘導(dǎo)凋亡活性的作用[4-7]。β-谷甾醇可下調(diào)ERK1/2和上調(diào)Bcl-2/Bax抑制心肌細(xì)胞凋亡[8]。有研究發(fā)現(xiàn)[9]，PI3K/AKT/GSK3通路在PCOS發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。IGF1R/PI3K信號(hào)通路主要在卵巢顆粒細(xì)胞中發(fā)揮作用[10]。目前，有關(guān)PCOS排卵障礙中卵泡發(fā)育延遲和排除受阻的發(fā)病機(jī)制與顆粒細(xì)胞增殖、凋亡和分泌密切相關(guān)。因此，需要通過解決顆粒細(xì)胞增殖緩慢和凋亡增加的問題，以改善PCOS卵巢排卵障礙的狀態(tài)。然而，β-谷甾醇抗凋亡、促增殖的特點(diǎn)是否對(duì)顆粒細(xì)胞具有具體作用也尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬通過檢測β-谷甾醇對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的增殖與凋亡及其對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)表達(dá)的影響，為PCOS卵泡發(fā)育障礙的機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要細(xì)胞株 人卵巢顆粒細(xì)胞系（KGN）由寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要藥物和試劑 β-谷甾醇（MCE公司），P-PI3KCA抗體（Affinity公司），PI3K（Abcam公司），AKT、P-AKT抗體、Caspase-3、GAPDH抗體（博奧森公司），Annexin V-FITC碘化丙啶（PI）雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（BD）公司，DAPI染色液、免疫熒光抗兔CY3和FITC二抗（Thermo Fisher公司）、HRP標(biāo)記二抗（博奧森公司）、CCK-8細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期檢測試劑盒、PI染色液、全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白含量檢測試劑盒、ECL發(fā)光液（凱基生物公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清+1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液于37℃、5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)KGN。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及試劑配制 分為對(duì)照組和β-谷甾醇處理組；β-谷甾醇處理組：10、20、40和80μmol·L-1的β-谷甾醇處理KGN細(xì)胞。對(duì)照組：無藥物處理的細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。1 g的β-谷甾醇粉末溶解于0.5 mL DMSO+29.64 mL DMEM培養(yǎng)液中配制成80 mmol·L-1母液，使用時(shí)參照說明書稀釋成80μmol·L-1工作濃度。

1.2.3 CCK-8檢測不同濃度β-谷甾醇對(duì)KGN細(xì)胞增殖的影響 收集對(duì)數(shù)生長期KGN細(xì)胞，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，均勻接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，β-谷甾醇處理組分別設(shè)置10、20、40和80μmol·L-1濃度梯度，對(duì)照組為0μmol·L-1，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，然后每孔分別加入10μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱再培養(yǎng)4 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測其光密度（OD）值，確定細(xì)胞增殖情況。

1.2.4 CCK-8檢測β-谷甾醇作用不同時(shí)間對(duì)KGN細(xì)胞增殖的影響 收集對(duì)數(shù)生長期KGN細(xì)胞，均勻接種于96孔板，添加20μmol·L-1的β-谷甾醇處理細(xì)胞，分別培養(yǎng)0、12、24、36和48 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6個(gè)復(fù)孔，在不同的時(shí)間點(diǎn)加10μL CCK-8，培養(yǎng)4 h檢測OD值，確定細(xì)胞增殖情況。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測β-谷甾醇對(duì)KGN細(xì)胞凋亡的影響 20μmol·L-1的β-谷甾醇處理24 h后，用不含EDTA胰酶消化對(duì)照組和β-谷甾醇處理組，收集5×105個(gè)細(xì)胞。PBS洗滌2次，每管加入500μL 1×Binding Buffer 500μL重懸細(xì)胞，每管加入5μL Annexin V-FITC混勻后，室溫避光孵育15 min，再向每管加入5μL Propidium Iodide（PI）混勻，室溫避光孵育5 min，用流式細(xì)胞儀上機(jī)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次取均值計(jì)算細(xì)胞凋亡率。凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/（凋亡細(xì)胞數(shù)+正常細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)測定β-谷甾醇對(duì)KGN細(xì)胞周期的影響 對(duì)數(shù)生長期1×104個(gè)/mL KGN細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后加入20μmol·L-1的β-谷甾醇處理24 h，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，消化離心收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，細(xì)胞懸液低速渦旋振蕩同時(shí)加入70%乙醇后，4℃固定細(xì)胞過夜。次日離心沉淀細(xì)胞，預(yù)冷PBS清洗離心，重懸細(xì)胞，每個(gè)樣品加入400μL PI染色液，37℃避光孵育30 min，用流式細(xì)胞儀檢測，再用Modifit軟件分析顆粒細(xì)胞在不同周期中的比例。

1.2.7 細(xì)胞免疫熒光法檢測KGN細(xì)胞內(nèi)PPI3KCA、P-AKT和Caspase-3蛋白定位和分布 將KGN細(xì)胞固定、漂洗、TritonX-100透化、封閉，滴加P-PI3KCA（1∶100）、P-AKT（1∶200）和Caspase-3抗體（1∶100）一抗，濕盒4℃孵育過夜，陰性對(duì)照用PBS代替一抗。PBS洗3次，每次5 min；加CY3和FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶200）熒光二抗25℃避光孵育1 h。PBS洗5次，每次5 min，DAPI染核，PBS洗滌，抗熒光淬滅劑封固，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)P-PI3KCA、P-AKT和Caspase-3蛋白的定位和分布，并避光拍照。

1.2.8 Western blot技術(shù)檢測KGN細(xì)胞PPI3KCA、P-AKT、Caspase-3蛋白的表達(dá) 對(duì)照組和β-谷甾醇組KGN細(xì)胞加入預(yù)冷的裂解液，于冰浴中反復(fù)用1 mL移液器吹打裂解。BCA測定蛋白濃度，將蛋白調(diào)整至統(tǒng)一濃度后，加入5×上樣緩沖液，沸水浴10 min蛋白變性后電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%BSA封閉2 h，TBST洗膜后加入GAPDH抗體（1∶1000稀釋）、AKT（1∶300）、PI3K（1∶400）、P-PI3KCA抗體（1∶300稀釋）、PAKT抗體（1∶500稀釋）和Caspase-3抗體（1∶400稀釋），4℃過夜。次日，TBST洗膜，加入HRP山羊抗兔IgG（1∶20000稀釋），室溫孵育2 h，TBST洗膜，加入ECL發(fā)光液曝光并拍照。運(yùn)用Image Lab圖像分析軟件測定條帶灰度值，并計(jì)算PPI3KCA/PI3K、P-AKT/AKT和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度β-谷甾醇對(duì)KGN細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果顯示，與對(duì)照組（0μmol·L-1）比較，添加20μmol·L-1β-谷甾醇促進(jìn)KGN細(xì)胞增殖的作用最強(qiáng)（P＜0.01），當(dāng)β-谷甾醇濃度增至40、80μmol·L-1時(shí)，β-谷甾醇處理組細(xì)胞增殖能力與對(duì)照組間相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），因此，根據(jù)藥理學(xué)Fisher原則中最低有效濃度與最低中毒濃度的原則，選擇20μmol·L-1β-谷甾醇培養(yǎng)KGN細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖1。

圖1 CCK-8法檢測不同濃度β-谷甾醇對(duì)KGN細(xì)胞增殖的影響

2.2 β-谷甾醇作用不同時(shí)間對(duì)KGN細(xì)胞增殖的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示，添加20μmol·L-1β-谷甾醇的KGN細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間，培養(yǎng)0、12、36、48與24 h相比KGN細(xì)胞分裂增殖降低（P＜0.01），故選擇添加20μmol·L-1β-谷甾醇培養(yǎng)KGN細(xì)胞24 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖2。

圖2 β-谷甾醇作用不同時(shí)間對(duì)KGN細(xì)胞增殖的影響

2.3 β-谷甾醇對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，20μmol·L-1β-谷甾醇處理組培養(yǎng)24 h，KGN細(xì)胞總凋亡率降低（P＜0.05），見圖3。

2.4 β-谷甾醇對(duì)KGN細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，20μmol·L-1β-谷甾醇作用24 h能增加S+G2/M期細(xì)胞所占比例，減少G0/G1期細(xì)胞所占比例（P均＜0.05），見表1。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測β-谷甾醇對(duì)KGN細(xì)胞凋亡的影響

表1 β-谷甾醇對(duì)KGN細(xì)胞周期分布的影響（±s，%）

表1 β-谷甾醇對(duì)KGN細(xì)胞周期分布的影響（±s，%）

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2.5 細(xì)胞免疫熒光檢測KGN細(xì)胞內(nèi)P-PI3KCA、P-AKT、Caspase-3蛋白表達(dá)定位

熒光顯微鏡下觀察顯示，綠色熒光定位于胞核和胞質(zhì)，即P-PI3KCA、P-AKT、Caspase-3在顆粒細(xì)胞胞核和胞質(zhì)表達(dá)，見圖4。

2.6 Western blot檢測β-谷甾醇對(duì)KGN細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測KGN細(xì)胞內(nèi)P-PI3KCA、P-AKT和凋亡家族中Caspase-3蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，β-谷甾醇處理組P-PI3KCA蛋白和P-AKT蛋白表達(dá)上調(diào)，Caspase-3蛋白表達(dá)下調(diào)（P均＜0.05），見圖5。

3 討論

圖4 細(xì)胞免疫熒光檢測P-PI3KCA、P-AKT和Caspase-3在KGN細(xì)胞中的表達(dá)定位（×200）

圖5 Western blot檢測β-谷甾醇對(duì)KGN細(xì)胞Caspase-3、P-PI3KCA/PI3K、P-AKT/AKT蛋白表達(dá)的影響

PCOS的高發(fā)病率嚴(yán)重影響女性生活質(zhì)量，其臨床表型多為雄激素過多、排卵障礙和卵巢多囊腔樣改變，PCOS顆粒細(xì)胞數(shù)量的減少以及顆粒細(xì)胞增殖受抑制會(huì)直接影響PCOS女性排卵，導(dǎo)致不孕。因此，顆粒細(xì)胞作為PCOS卵巢卵泡發(fā)育的重要功能細(xì)胞，其增殖和凋亡會(huì)影響雌孕激素的產(chǎn)生，同時(shí)也會(huì)影響卵母細(xì)胞的發(fā)育、成熟以及微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[11]。本研究中CCK-8結(jié)果顯示，20μmol·L-1的β-谷甾醇促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖，在培養(yǎng)24 h時(shí)顆粒細(xì)胞的增殖能力更加明顯。流式細(xì)胞結(jié)果顯示，細(xì)胞增殖加快，細(xì)胞新陳代謝增加，死亡細(xì)胞數(shù)相對(duì)較多。細(xì)胞增殖的促進(jìn)或抑制是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期各階段的DNA含量來實(shí)現(xiàn)的，本實(shí)驗(yàn)中流式細(xì)胞儀測定顆粒細(xì)胞DNA含量的結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，β-谷甾醇處理組顆粒細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞所占比例減少，S+G2/M期細(xì)胞所占比例增加，證實(shí)β-谷甾醇發(fā)揮促顆粒細(xì)胞增殖作用。

PI3K/AKT信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的重要信號(hào)通路[12]，通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路能上調(diào)細(xì)胞增殖能力，抑制細(xì)胞凋亡。PI3K（Phosphatidylinositol 3-kinase）作為PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的直接上游關(guān)鍵分子，其亞基PIK3CA導(dǎo)致p110α酶活性的激活，從而刺激了不依賴生長因子的細(xì)胞生長[12]。AKT是PI3K的關(guān)鍵下游效應(yīng)分子，P-AKT作為AKT的活化形式，能磷酸化許多與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的組件實(shí)現(xiàn)細(xì)胞存活[13]。而且PI3K激活能有效上調(diào)AKT的磷酸化水平，從而激活mTOR調(diào)控細(xì)胞生物過程，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞存活，在顆粒細(xì)胞的增殖、卵泡的發(fā)育、閉鎖和黃體過程中也扮演著重要的角色[14]。本文采用β-谷甾醇處理顆粒細(xì)胞，結(jié)果提示，與對(duì)照組相比較，β-谷甾醇干預(yù)顆粒細(xì)胞后P-AKT和P-PI3KCA表達(dá)上調(diào)，β-谷甾醇組促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖。細(xì)胞凋亡的凋亡啟動(dòng)階段，細(xì)胞會(huì)存在膜受體途徑、細(xì)胞色素C釋放和Caspases激活等途徑[15]。Caspase-3是位于哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡通路下游關(guān)鍵的死亡蛋白酶，最重要的凋亡蛋白酶，其表達(dá)量直接反映細(xì)胞凋亡程度[16]。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，β-谷甾醇處理顆粒細(xì)胞后Caspase-3表達(dá)下調(diào)，提示β-谷甾醇抑制顆粒細(xì)胞凋亡。Annexin V FITC/PI檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在加入β-谷甾醇處理顆粒細(xì)胞24后（即細(xì)胞培養(yǎng)48 h時(shí)），β-谷甾醇可降低顆粒細(xì)胞凋亡率，該結(jié)果與已有的報(bào)道[17-18]結(jié)論一致。

綜上所述，20μmol·L-1的β-谷甾醇可通過增加P-AKT和P-PIK3CA蛋白表達(dá)水平促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖，且降低Caspase-3蛋白表達(dá)水平，從而抑制顆粒細(xì)胞凋亡。這為PCOS在PI3K/AKT/mTOR的信號(hào)通路及作用效果的研究提供了一定的依據(jù)。