胡亞楠，李 健，胡振興，吳海峰，何 瑞，李廣永，李培軍

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院泌尿外科，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病的一種常見并發(fā)癥。DN患者通常表現(xiàn)為濾過率降低、蛋白尿，最終導(dǎo)致腎功能衰竭。足細(xì)胞作為腎小球?yàn)V過膜的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)之一，有著重要的屏障作用，可以有效阻止血漿蛋白的泄漏。足細(xì)胞損傷是DN進(jìn)展的一個關(guān)鍵因素，足細(xì)胞再生能力有限，因此足細(xì)胞損傷的程度通常被視為影響DN預(yù)后的重要因素。既往研究表明[1]，足細(xì)胞損傷是DN患者導(dǎo)致腎小球疾病的重要早期事件?，F(xiàn)有的抗高血糖治療方法未能有效治療DN，因此，開發(fā)新的DN治療方法有助于改善DN患者的結(jié)局。Nesfatin-1由胃黏膜中的X/A樣細(xì)胞分泌，分別通過下丘腦起刺激和抑制食物攝入的作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Nesfatin-1對糖尿病及其并發(fā)癥有明顯改善作用[2]，但Nesfatin-1對高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用尚未有研究報(bào)道。因此本研究利用高糖誘導(dǎo)腎臟足細(xì)胞，模擬DN的足細(xì)胞病變，給予Nesfatin-1干預(yù)，探索Nesfatin-1對高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，旨在為臨床治療DN提供新的治療思路及方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

二氧化碳培養(yǎng)箱（利康生物醫(yī)療科技控股有限公司），低溫離心機(jī)（Eppendorf公司），全波長酶標(biāo)儀（Thermo Fisher公司），倒置顯微鏡（OLYMPUS公司），SDS-PAGE電泳儀設(shè)備（Bio-Rad公司）。

1.2 細(xì)胞系

永生化小鼠足細(xì)胞系（MPC-5）（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究所）。

1.3 試劑及抗體

DMEM普通和高糖培養(yǎng)基［賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司］；BCA試劑盒及SDS-PAGE凝膠配置試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；細(xì)胞凍存液和CCK-8試劑盒（南京建成生物工程研究所）；胰蛋白酶和新生小牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；DMSO（純度99.5%，無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司）；Nephrin和β-actin單克隆抗體（abcam公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；Western blot ECL（上海雅酶生物科技有限公司）。

1.4 溶液配制

（1）完全培養(yǎng)基配制：5 mL胎牛血清、45 mL DMEM普通培養(yǎng)基和500μL雙抗混勻；（2）高糖培養(yǎng)基配制：5 mL胎牛血清、45 mL DMEM高糖培養(yǎng)基和500μL雙抗混勻；（3）含Nesfatin-1的溶液配制：取10-8M的Nesfatin-1 12.5μL加入50 mL的高糖培養(yǎng)基混勻。

1.5 方法

1.5.1 MPC-5細(xì)胞培養(yǎng)和處理 MPC-5細(xì)胞在含有10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基（5.6 mmol·L-1葡萄糖）中培養(yǎng)，溫度為37℃，含5%CO2。將MPC-5細(xì)胞接種于96孔板和6孔板中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。分組：對照組（5.6 mmol·L-1葡萄糖）、高糖組（25 mmol·L-1葡萄糖）、治療組（25 mmol·L-1葡萄糖+10-8M Nesfatin-1）[3]。造模前去血清饑餓足細(xì)胞16 h，高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)MPC-5細(xì)胞24 h，后加入Nesfatin-1進(jìn)行治療。由于Nesfatin-1的半衰期很短（9～10 min），因此作用時間選擇1 h[3]。

1.5.2 倒置顯微鏡觀察MPC-5細(xì)胞形態(tài)、CCK-8法檢測其存活率 將MPC-5細(xì)胞以2000個/孔的密度接種于96孔板中貼壁8 h，饑餓16 h，高糖培養(yǎng)基處理24 h后在100倍顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍圖，然后加入Nesfatin-1處理1 h后再次進(jìn)行顯微鏡下觀察及拍圖。加入CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活性。在450 nm波長處測定吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=［（實(shí)驗(yàn)孔吸光度-空白孔吸光度）/（對照孔吸光度-空白孔吸光度）］×100%。

1.5.3 Western blot檢測MPC-5細(xì)胞中Nephrin蛋白的表達(dá) MPC-5細(xì)胞樣品中的蛋白質(zhì)用RIPA裂解液，在冰上裂解30 min，轉(zhuǎn)移至離心管中，12000 r·min-1，4℃離心10 min。用BCA試劑盒測量蛋白濃度。將蛋白樣品與5倍上樣緩沖液以4∶1的比例混合，100℃煮沸10 min使蛋白變性。每孔加入40μg的蛋白樣品，經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳，80 V電壓電泳30 min后，溴酚藍(lán)達(dá)到分離膠時將電壓調(diào)整到120 V繼續(xù)電泳。電泳結(jié)束后，在200 mA電流、4℃轉(zhuǎn)膜120 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素PVDF膜。取出硝酸纖維素膜，放在5%脫脂奶粉中，37℃孵育120 min。然后用孵育一抗（Nephrin：1∶500；β-actin：1∶2000）4℃孵育過夜。用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（兔抗：1∶2000；鼠抗：1∶5000）37℃孵育120 min，并用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑顯影。使用軟件Image J對圖像進(jìn)行掃描和分析確定靶蛋白與內(nèi)參的比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)使用Graph Pad Prism 8統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Nesfatin-1改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞形態(tài)改變

顯微鏡下觀察可見，對照組足細(xì)胞呈多邊形，由胞體向外伸出足突，而25 mmol·L-1高糖條件下的高糖組可見足細(xì)胞足突出現(xiàn)回縮，細(xì)胞大部分呈鵝卵石狀，細(xì)胞胞體較對照組變大。圖中紅色五角星標(biāo)注為高糖誘導(dǎo)所致足細(xì)胞胞體變大，足突回縮。治療組細(xì)胞胞體較高糖組變小，形態(tài)有向多邊形轉(zhuǎn)化的趨勢，接近對照組。圖中紅色五角星標(biāo)注為經(jīng)處理后足細(xì)胞胞體變小，足突恢復(fù)，見圖1。

2.2 Nesfatin-1提升高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞存活率

高糖組足細(xì)胞存活率低于對照組（P＜0.05），而Nesfatin-1處理后的治療組足細(xì)胞存活率高于高糖組（P＜0.05），見圖2。

圖2 CCK-8檢測各組MPC-5細(xì)胞存活率

2.3 Nesfatin-1可逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷

通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測到足細(xì)胞標(biāo)記物Nephrin蛋白表達(dá)的相對水平在高糖培養(yǎng)后降低。而在給予高糖后再給予Nesfatin-1處理，Nephrin蛋白表達(dá)均升高（P均＜0.05），見圖3。

3 討論

DN是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥。糖尿病是一種常見的危險(xiǎn)因素，可導(dǎo)致足細(xì)胞損傷、蛋白質(zhì)及細(xì)胞器的堆積，如不及時清除可引起細(xì)胞毒性，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死，進(jìn)而導(dǎo)致不可逆的足細(xì)胞損傷和功能障礙，從而減少足細(xì)胞的數(shù)量[4]。足細(xì)胞是終末分化的腎小球上皮細(xì)胞，是腎小球?yàn)V過屏障的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，在防止血漿蛋白泄漏方面起重要作用。足細(xì)胞的損傷和丟失會導(dǎo)致蛋白尿，這是DN的一個標(biāo)志和預(yù)測指標(biāo)[5]。

Nesfatin-1是一種新發(fā)現(xiàn)的厭食性神經(jīng)肽，由82個氨基酸組成，具有明顯的厭食作用，參與饑餓和脂肪儲存的調(diào)節(jié)，具有強(qiáng)大的代謝調(diào)節(jié)作用[6]。中樞和外周注射Nesfatin-1都能減少嚙齒動物的攝食量和體質(zhì)量[7]。有研究[8]報(bào)道，向第三腦室灌注Nesfatin-1可以抑制肝臟葡萄糖的產(chǎn)生和促進(jìn)葡萄糖的攝取，這些代謝功能使Nesfatin-1成為治療肥胖癥和糖尿病的新型候選藥物；Nesfatin-1的結(jié)合部位主要存在于腎臟等組織[9]；足細(xì)胞損傷和丟失時，腎小球?yàn)V過屏障的完整性將嚴(yán)重受損，導(dǎo)致蛋白尿，促進(jìn)腎小球硬化，進(jìn)而加速DN的進(jìn)展[10-11]。2型糖尿?。═2DM）患者的血漿中Nesfatin-1水平會升高，而外周血的Nesfatin-1有助于維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)。研究顯示Nesfatin-1參與了糖尿病的發(fā)生發(fā)展[6]，但Nesfatin-1是否對DN有改善作用尚不可知。因此，本研究利用細(xì)胞模型探討Nesfatin-1是否可以改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。

以往的研究顯示，葡萄糖的毒性與細(xì)胞的滲透壓無關(guān)[3]。本研究中25 mmol·L-1高糖條件下可見足細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了改變，由多邊形有胞體向外伸出足突，變?yōu)轾Z卵石狀足突出現(xiàn)回縮且細(xì)胞胞體變大。經(jīng)Nesfatin-1治療后細(xì)胞形態(tài)有向多邊形轉(zhuǎn)化的趨勢，胞體變小，接近對照組。結(jié)果表明高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞形態(tài)的改變，而給予Nesfatin-1后，可改善高糖誘導(dǎo)對足細(xì)胞形態(tài)的損害。隨后測定細(xì)胞存活率發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)降低了足細(xì)胞存活率，而Nesfatin-1處理后可以改善甚至促進(jìn)足細(xì)胞存活率，結(jié)果證實(shí)了高糖可誘導(dǎo)足細(xì)胞存活率的降低及Nesfatin-1對細(xì)胞存活率的逆轉(zhuǎn)作用。高糖抑制細(xì)胞存活，經(jīng)過Nesfatin-1治療后可以減弱它的抑制作用，因此Nesfatin-1可能有雙向作用，在高糖的時候改善高糖環(huán)境，低糖環(huán)境下促進(jìn)糖的吸收從而改善低糖環(huán)境。

為進(jìn)一步證實(shí)高糖對足細(xì)胞的損害作用和Nesfatin-1對足細(xì)胞的保護(hù)作用，本研究通過Western blot檢測結(jié)果進(jìn)行了進(jìn)一步的佐證。Nephrin是足細(xì)胞的特異標(biāo)記蛋白，具有離子通道和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，在足細(xì)胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[8]。糖尿病患者發(fā)生足細(xì)胞損傷，Nephrin蛋白的表達(dá)水平降低。本研究發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞Nephrin蛋白的表達(dá)水平降低，在經(jīng)Nesfatin-1治療后足細(xì)胞標(biāo)志蛋白Nephrin蛋白的表達(dá)增加，證明足細(xì)胞損傷得到逆轉(zhuǎn)。這些新的數(shù)據(jù)提供了Nesfatin-1可以改善高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的證據(jù)。本研究中Nesfatin-1的保護(hù)作用表明，Nesfatin-1可能是開發(fā)干預(yù)DN新治療藥物有價(jià)值的先導(dǎo)。

綜上，Nesfatin-1可以保護(hù)足細(xì)胞免受高糖誘導(dǎo)的損傷。然而，Nesfatin-1如何改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷尚不清楚，Nesfatin-1對DN的改善作用也有待于進(jìn)一步研究。