付賽賽，秦廣利，夏威風，劉培培

(1.商丘職業(yè)技術學院，河南 商丘 476000； 2.商丘市動物衛(wèi)生監(jiān)督所)

隨著抗菌藥在獸醫(yī)臨床長期應用，臨床分離菌對各種抗生素類藥物的耐藥率都在逐年升高[1]。目前研究表明，大腸埃希菌的主動外排作用是產(chǎn)生多重耐藥的重要原因[2-4]，也是當前國內(nèi)外研究的熱點之一。主動外排系指大腸桿菌細胞內(nèi)膜存在的能量依賴性蛋白質(zhì)外輸泵，通過主動外排作用，可將藥物從菌體內(nèi)排出，使到達作用靶位點的藥量減少，不足以發(fā)揮殺菌或抑菌作用[5]。大腸桿菌是發(fā)現(xiàn)外輸泵最多的一種細菌，在埃希氏大腸桿菌上發(fā)現(xiàn)了30多種外輸泵，但一般認為AcrAB-TolC是最主要的外輸泵[6,15]。本試驗主要研究大腸桿菌的誘導不同代數(shù)耐藥性與主動外排基因acrA表達量的關系，是外輸泵介導的大腸桿菌耐藥性研究中具有重要意義的步驟。

1 材料與方法

1.1試驗菌株 試驗菌株編號分別為：1、11、88、017、035、040、045、048、94、T7等10株。其各株對環(huán)丙沙星的最低抑菌濃度值(MIC)見表1。

表1 菌株環(huán)丙沙星的MIC值(μg/mL)

1.2試驗方法

1.2.1耐藥菌的誘導 使用環(huán)丙沙星對以上10株“耐藥菌”進行誘導培養(yǎng)。將1/2 MIC的環(huán)丙沙星溶液作為初始誘導濃度。37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，此即為1代，連續(xù)共計傳30代，每隔5代測定MIC，并調(diào)整LB肉湯中的藥物濃度，使之始終保持1/2 MIC。并將誘導的菌液劃線于麥康凱培養(yǎng)基，觀察菌落形態(tài)及是否污染有雜菌。若在傳代過程中菌株生長不良，則使用上代菌株在無藥物狀態(tài)下使細菌生長，但不計代數(shù)，然后加入1/2 MIC的藥物繼續(xù)傳代。挑取每隔5代的菌株，并在每個原有菌株編號下標5、10、15、20、25、30表示誘導的代數(shù)，共得到誘導培養(yǎng)的菌株60株，用于下一步誘導菌株外排表達量的測定。

1.2.2總RNA抽提 利用Trizol法。

1.2.3濃度檢測 取2 μL儲存液加入另一個EP管中，再加入98 μL無RNase水，離心混勻，以無RNase水作空白對照，核酸定量檢測儀測定RNA的吸收值，根據(jù)OD260值計算RNA的濃度，以OD260/OD280的比值判斷其純度。

1.2.5cDNA的PCR擴增 以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進行PCR擴增，按照比例配制反應體系，反應條件為：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性30 s、62 ℃退火30 s、72 ℃ 60 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應結(jié)束后，取5 μL PCR擴增產(chǎn)物，1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳。

1.3PCR產(chǎn)物的純化與回收

1.3.1持家基因的擴增 將稀釋好的膠回收PCR產(chǎn)物作為模板進行擴增，反應體系為20 μL：SYBR real-time PCR premature 10 μL；FP、RP各0.4 μL，不同濃度稀釋的模板2 μL，超純水7.2 μL。

1.3.3實時定量PCR檢測mRNA水平 利用本研究所建立的實時定量RT-PCR的方法對樣品中持家基因gapA和大腸桿菌主動外排基因acrA進行定量檢測，得到各個檢測樣品的Ct值。利用持家基因做校正，對大腸桿菌主動外排基因mRNA相對表達水平進行分析。

1.4相對表達水平計算 采用2-△△Ct法計算各基因在不耐藥程度菌株中的相對表達水平，具體方法如下：測定各個檢測樣品的Ct值，每個樣品重復 2次，并由熔解曲線判定PCR反應的特異性，然后由測得的各菌株的主動外排基因acrA基因的Ct值，減去相同菌株的持家基因gapA的Ct值，即得校正值，記做△Ct，即△Ct目的基因=Ct目的基因-Ct持家基因，然后用臨床菌株各個基因的△Ct值，減去大腸桿菌標準菌株ATCC25922對應的△Ct值，即得△△Ct，即△△Ct=△Ct臨床株-△Ct標準菌株，各目的基因mRNA的相對表達量以2-△△Ct表示。

2 結(jié)果與分析

2.1最低抑菌濃度 各個誘導大腸桿菌的MIC值如表2所示。

從表2可以看出，不同菌株的大腸桿菌隨著在含有1/2 MIC的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，各個大腸桿菌的最低抑菌濃度(MIC)均有所增加。菌株94、035、040、045、048培養(yǎng)到30代時， 最低抑菌濃度(MIC)變?yōu)樵瓉淼?倍；菌株88、017的MIC都變?yōu)樵瓉淼?倍，但是菌株88的MIC值經(jīng)歷先變小后變大的過程；而菌株1的耐藥性相對比較穩(wěn)定，其最低抑菌濃度一直是256 μg/mL。菌株11在用含有1/2 MIC環(huán)丙沙星的培養(yǎng)液培養(yǎng)時一直未長出菌體，1/4 MIC、1/8 MIC、2 μg/mL、1 μg/mL也未長出菌體，可能是該大腸桿菌發(fā)生變異，導致對環(huán)丙沙星的耐藥性喪失。

表2 環(huán)丙沙星對誘導菌株MIC值的測定結(jié)果(μg/mL)

2.2相對表達水平 采用2-△△Ct法計算不同耐藥菌株主動外排基因 acrA的相對表達量，結(jié)果見表3。

表3 不同耐藥程度臨床菌株主動外排基因acrA的相對表達量

在1/2 MIC培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株1，菌株1的MIC值始終沒有發(fā)生變化，但是acrA的表達量卻增加很大；菌株017的acrA表達量呈波浪式變化，總體趨勢是增加的；菌株035與94在耐藥性培養(yǎng)中雖然所測MIC有所增加，但其主動外排基因acrA的表達量卻呈遞減的趨勢；菌株040的acrA表達量先下降然后再急速上升；菌株T7主動外排基因acrA的表達量先減少，再增加，后又減少，變化幅度相當大；菌株048的acrA的表達量先減少后增加，菌株045的acrA基因表達量與菌株017的acrA基因表達量有點相似，也呈波浪式變化。從整體結(jié)果來看，除了菌株035和菌株94外，其它幾株菌株的acrA表達量均增加，說明大腸桿菌的耐藥性與主動外排基因acrA的表達量有相關性 。

3 討論與分析

普遍的觀點認為抗菌藥物的使用是病原菌產(chǎn)生耐藥性的關鍵所在。由于抗菌藥長期持續(xù)的不當使用，給細菌的生存環(huán)境造成了選擇性壓力，這種環(huán)境壓力因素可以通過多種機制導致病原菌對抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性[7]。藥物外輸泵是一類位于細胞膜上的具有特殊結(jié)構(gòu)的膜轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)，其作用機理為當細胞內(nèi)的藥物濃度聚集達到一定數(shù)值時，藥物外輸泵系統(tǒng)相關mRNA的表達增加，結(jié)果使細胞膜上外輸泵的數(shù)量增加，使細胞內(nèi)的藥物被泵出，從而使細菌耐藥[10]。本試驗依據(jù)大腸桿菌的耐藥機理，將大腸桿菌在人工選擇性壓力環(huán)境下培養(yǎng)，以期大腸桿菌的MIC值發(fā)生變化。從實驗結(jié)果來看，除了菌株1的MIC值沒有發(fā)生變化，菌株11 對環(huán)丙沙星的耐藥性喪失，其它幾株大腸桿菌的MIC值變化2-8倍不等。MIC變化不一樣，可能不僅與藥物外輸泵有關，還與其它耐藥機制有關。

現(xiàn)已公認AcrAB-TolC是大腸埃希氏菌最主要的外輸泵，AcrAB-TolC包括藥物質(zhì)子轉(zhuǎn)運子AcrB、周質(zhì)融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC[8,11,15]。其中acrA基因的表達可造成大腸桿菌對多種藥物的耐藥性，因此，主動外排基因acrA表達量對大腸桿菌的耐藥性有著至關重要的作用。普遍認為大腸桿菌對環(huán)丙沙星的耐藥性與主動外排基因acrA的表達量呈正相關。但是此次的實驗結(jié)果卻不盡相同，菌株1的MIC值未發(fā)生變化，但acrA表達量增加了許多；菌株017和045均呈現(xiàn)波浪式變化，菌株035和94的MIC雖然都升高了，但acrA的表達量卻減少；其它幾株菌株的acrA表達量均增加。說明大腸桿菌acrA基因的表達量與MIC值有一定的相關性，但是也不一定呈正相關。對此種現(xiàn)象產(chǎn)生的原因，推測可能是由于不止一種外輸泵的激活，或是可能還有其他的耐藥機制的作用。因為細菌的耐藥有著多種而復雜的機制[9,13]，或者外輸泵外排能力顯著提高。