何姍 王智康 楊陽(yáng) 牟玥薇 黃玉碧 余國(guó)武

（作物科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)示范中心 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130）

NAC（NAM，ATAF1/2，CUC2）是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，NAC的命名由最早發(fā)現(xiàn)的矮牽牛（Petunia hybrida Vilm.）NAM基因、擬南芥ATAF1/2基因和CUC1/2基因首字母組成［1-3］。NAC蛋白的N端含有一段與NAM蛋白高度同源的保守氨基酸序列，被稱為NAC結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域起著結(jié)合DNA或蛋白的功能。不同NAC蛋白的C端則表現(xiàn)出高度的變異［4］。目前已在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了超過(guò)110個(gè)的NAC蛋白，在水稻中發(fā)現(xiàn)了超過(guò)150個(gè)，在玉米中發(fā)現(xiàn)了超過(guò)130個(gè)［5-7］。這些NAC轉(zhuǎn)錄因子參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育、環(huán)境脅迫以及激素信號(hào)傳導(dǎo)等多種生命活動(dòng)［8-10］。

NAC蛋白廣泛存在于陸地植物中，但近年來(lái)也在水生的綠藻中發(fā)現(xiàn)了NAC蛋白，意味著在陸地植物出現(xiàn)前，NAC蛋白已經(jīng)出現(xiàn)并發(fā)揮作用［11］。陸生植物與水生植物的最大區(qū)別之一在于，陸生植物進(jìn)化出了專門用于水分傳導(dǎo)和儲(chǔ)存的細(xì)胞，許多NAC蛋白調(diào)控植物篩管和導(dǎo)管分子的形成，對(duì)保障陸生植物正常水分供需極其重要［12-13］。苔蘚PpVNS家族蛋白功能缺失突變體的導(dǎo)水細(xì)胞發(fā)育異常、孢子畸形，嚴(yán)重阻礙了植物的正常發(fā)育和繁衍，而在苔蘚和擬南芥中過(guò)表達(dá)PpVNS促進(jìn)了導(dǎo)水細(xì)胞的分化。且PpVNS在苔蘚和擬南芥中調(diào)控相似的基因網(wǎng)絡(luò)，這一基因在不同的物種中功能保守性高，意味著NAC轉(zhuǎn)錄因子可能參與了植物對(duì)陸地適應(yīng)過(guò)程中導(dǎo)水細(xì)胞和支持細(xì)胞的進(jìn)化［14］。不僅如此，植物在復(fù)雜的陸地自然環(huán)境中，常常遭遇高溫、干旱等非生物脅迫的挑戰(zhàn)，研究發(fā)現(xiàn)25%以上的NAC蛋白至少參與了植物對(duì)一種脅迫的響應(yīng)［15］。白楊BpNAC012能夠?qū)χ参锏拇紊谛纬杉胺巧锩{迫響應(yīng)起到積極的作用，過(guò)表達(dá)BpNAC012的植株次生壁明顯增厚，對(duì)鹽脅迫和滲透脅迫的抵抗能力明顯增強(qiáng)［16］。水稻 SNAC1（stress-responsive NAC1）的過(guò)表達(dá)使得水稻表現(xiàn)出明顯的抗旱性和耐鹽性，并且能顯著提高過(guò)表達(dá)植株的產(chǎn)量，在作物育種方面具有重要的意義［17］。另外，一些NAC蛋白表現(xiàn)出對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的雙重功能。棉花GhATAF1的過(guò)表達(dá)激活了包括ABA的應(yīng)答基因GhABI4在內(nèi)的多個(gè)脅迫響應(yīng)基因，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鹽的耐受性，但過(guò)表達(dá)植株對(duì)黃萎病病毒（Verticillium dahliae Kleb.）和灰酶（Botrytis cinerea）更加敏感，同時(shí)抑制了茉莉酸（JA）和水楊酸（SA）介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［18］。由此可見，NAC蛋白對(duì)逆境的響應(yīng)可能是影響多種激素信號(hào)網(wǎng)絡(luò)協(xié)同作用的結(jié)果。

脫落酸（abscisic acid，ABA）在植物的多種發(fā)育過(guò)程中和環(huán)境脅迫響應(yīng)中起著重要作用。模式植物擬南芥中有將近10%的編碼蛋白質(zhì)的基因受到ABA的調(diào)節(jié)，遠(yuǎn)高于其他的植物激素［19-20］。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多NAC蛋白能夠響應(yīng)ABA，如玉米ZmNAC071能抑制脅迫響應(yīng)基因表達(dá)進(jìn)而使得過(guò)表達(dá)擬南芥對(duì)ABA和滲透脅迫的敏感性增強(qiáng)［21］。ZmNAC84的表達(dá)受到H2O2的誘導(dǎo)，通過(guò)響應(yīng)H2O2信號(hào)參與到ABA誘導(dǎo)的抗氧化防御進(jìn)程，過(guò)表達(dá)ZmNAC84的煙草株系具有更強(qiáng)的抗旱能力，并且在干旱條件下具有更少的氧化損傷［22］。水稻OsNAC2通過(guò)結(jié)合非生物脅迫和ABA響應(yīng)通路的標(biāo)記基因OsLEA3（LATE EMBRYOGENESIS ABUNDANT 3）和 OsSAPK1（Stress-Activated Protein Kinases 1）基因的啟動(dòng)子，同時(shí)調(diào)節(jié)非生物脅迫反應(yīng)和ABA介導(dǎo)的反應(yīng)，并在ABA和非生物脅迫途徑之間起作用［23］。

玉米是第三大糧食作物，是食物和工業(yè)原料的重要來(lái)源，玉米灌漿期遭受干旱或鹽脅迫將導(dǎo)致產(chǎn)量下降［24-26］。而ABA對(duì)于玉米籽粒發(fā)育的影響更為復(fù)雜，施用外源ABA對(duì)產(chǎn)量的影響與施用的時(shí)間和劑量有關(guān)［27］。本研究對(duì)授粉后20 d的Mo17玉米胚乳蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，篩選得到了一個(gè)表達(dá)水平較高的轉(zhuǎn)錄因子NAC78，通過(guò)克隆了NAC78的開放閱讀框（ORF），并通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)NAC78的組織表達(dá)特性和對(duì)ABA、NaCl、PEG的響應(yīng)進(jìn)行了分析，為深入研究NAC78在玉米對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)和玉米胚乳發(fā)育過(guò)程中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)使用的植物材料為玉米骨干自交系Mo17，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供，取Mo17的根、莖、葉、花絲、花藥、授粉后15 d玉米棒中部的籽粒、胚及授粉后5-30 d胚乳用液氮迅速冷凍，置于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。取自交授粉?5 d的玉米棒中部籽粒置于含有50 μmol/L ABA的液體MS培養(yǎng)基中緩慢震蕩（50 r/min）培養(yǎng)48 h，同時(shí)以在不含有ABA的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)的籽粒作為對(duì)照，每12 h取出部分籽粒用液氮迅速冷凍并保存?zhèn)溆?。在培養(yǎng)室中種植Mo17玉米，待植株長(zhǎng)至三葉期時(shí)選取長(zhǎng)勢(shì)旺盛，生長(zhǎng)狀態(tài)一致的玉米苗澆灌NaCl（200 mmol/L）和PEG（25%）進(jìn)行脅迫處理，處理后0 h，1 h、6 h、12 h和24 h，取相同部位葉片用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

大腸桿菌感受態(tài)DH5α、BL21（DE3）購(gòu)自寶生物生物技術(shù)（北京）有限公司。

本試驗(yàn)中使用的總RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、重組克隆試劑盒、高保真DNA聚合酶購(gòu)自南京諾維贊生物科技有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒載體pMD19-T、限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ、SYBR染料購(gòu)自寶生物生物技術(shù)（北京）有限公司。引物（表1）合成及測(cè)序由成都擎科梓熙科技技術(shù)有限公司完成。

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in the experiment

1.2 方法

1.2.1 NAC78的克隆 提取授粉后15 d的Mo17胚乳總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以此為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后的產(chǎn)物電泳回收后連接克隆載體pMD19-T，提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證序列是否為目的序列。

1.2.2 NAC78的生物信息學(xué)分析 使用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分 析 NAC78的結(jié)構(gòu)域；利用Prot Scale程序（https：//expasy.org/cgibin/protscale.pl）分析蛋白質(zhì)疏水性；利用Prot-Param分析蛋白的理化性質(zhì)；利用Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）預(yù)測(cè)NAC78的三維結(jié)構(gòu)；用MEGA6.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹；用 ESPript3.0（http：//espript.ibcp.fr/ESPript/cgibin/ESPript.cgi）進(jìn)行氨基酸序列的多重比對(duì)；利用在線軟件PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測(cè)啟動(dòng)子的順式作用元件。

1.2.3 NAC78的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)分析 實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x器為伯樂(lè)CFX96。依照SYBR Green PCR Master Mix說(shuō)明書加入試劑、模版、引物和ddH2O。運(yùn)行條件：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性15 s；55℃退火15 s；72℃延伸10 s；此過(guò)程45個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)。以玉米Actin基因作為內(nèi)參，試驗(yàn)均進(jìn)行了3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 NAC78基因的克隆

提取Mo17的胚乳總RNA，以Mo17自交授粉后15 d的玉米胚乳cDNA作為模版，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到約1 800 bp的片段，挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序后得到NAC78開放閱讀框的核苷酸序列。測(cè)序得到的NAC78核苷酸序列長(zhǎng)度為1 830 bp，編碼609個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白的分子量為67.45 kD，等電點(diǎn)為5.19，為親水性蛋白（圖1-A）。預(yù)測(cè)NAC78蛋白氨基酸序列7-133位氨基酸序列為NAM結(jié)構(gòu)域（圖1-B），這一結(jié)構(gòu)域起著結(jié)合DNA的作用。使用Phyre2對(duì)NAC78蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)模型N端為α螺旋環(huán)繞平行的β片層構(gòu)成的立體結(jié)構(gòu)，C端為無(wú)序結(jié)構(gòu)（圖1-C）。多序列比對(duì)結(jié)果顯示，玉米NAC78與其在水稻、高粱、擬南芥等植物中的同源基因相比，蛋白的N端是高度保守的，由8個(gè)α螺旋和7個(gè)β片層構(gòu)成，分為A-E 5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域（圖2）。選取擬南芥、水稻、普通小麥、馬鈴薯、番茄、煙草等17種植物中NAC78的同源序基因的氨基酸序列，通過(guò)鄰接法（1 000 bootstrap）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。結(jié)果顯示，玉米與谷子、高粱、水稻、普通小麥、香蕉聚為一支，它們均屬于禾本科單子葉植物，親緣關(guān)系較近，且玉米NAC78與谷子NAC86的親緣關(guān)系最為接近（圖3）。

2.2 NAC78組織表達(dá)模式分析

為了解NAC78的表達(dá)模式，本試驗(yàn)提取了玉米不同組織的RNA，通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)探究了NAC78在Mo17玉米的根、莖、葉、花絲、花藥、胚、胚乳、籽粒及自花授粉后5-30 d的胚乳中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，NAC78在玉米各個(gè)組織均有表達(dá)，自交授粉后15 d胚乳中的表達(dá)量顯著高于其他的組織。由于NAC78在胚乳中的表達(dá)量最高，因此本試驗(yàn)檢測(cè)了發(fā)育不同時(shí)期胚乳中NAC78的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，NAC78的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢(shì)，授粉后15 d的相對(duì)表達(dá)量較第5天增加52.52倍（圖4）。Chen等［28］的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示在授粉后6-28 d NAC78相對(duì)表達(dá)量的變化情況也呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。由此推測(cè)NAC78在胚乳的發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。

圖1 NAC78蛋白的生物信息學(xué)分析Fig.1 Bioinformatics analysis of NAC78 protein

2.3 NAC78對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)

根據(jù)Maize GDB數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息，對(duì)NAC78翻譯起始位點(diǎn)ATG上游1 500 bp的啟動(dòng)子序列進(jìn)行了順式作用元件的預(yù)測(cè)和分析。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，NAC78基因上游多個(gè)光響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（表2）。預(yù)測(cè)結(jié)果中含有7個(gè)ARBE類響應(yīng)ABA的順式元件，因此本試驗(yàn)使用50 μmol/L ABA處理Mo17自花授粉后15 d的玉米籽粒，檢測(cè)處理不同時(shí)間的玉米籽粒中NAC78的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況。結(jié)果顯示，NAC78的表達(dá)受到ABA的誘導(dǎo)，其表達(dá)水平在ABA處理后顯著升高，在ABA處理籽粒6 h后相對(duì)表達(dá)量較0 h增加了11.4倍（圖5）。ABA與植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)有密切聯(lián)系，為探究NAC78是否與逆境響應(yīng)相關(guān)，對(duì)三葉期幼苗進(jìn)行NaCl和PEG處理，熒光定量結(jié)果表明，NAC78的表達(dá)受到NaCl與PEG的誘導(dǎo)，相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，NaCl和PEG處理植株6 h后在葉片中的相對(duì)表達(dá)量分別增加了1.87和2.69倍（圖6）。

3 討論

本試驗(yàn)從Mo17玉米胚乳中克隆得到了NAC78基因，其N端具有的典型的NAM結(jié)構(gòu)域，屬于NAC轉(zhuǎn)錄因子家族。Phyre2三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示NAC78的N端結(jié)構(gòu)是由α螺旋環(huán)繞反向平行的β片層構(gòu)成的，與ANAC019蛋白N端的結(jié)構(gòu)相類似，推測(cè)NAC78的N端與ANAC019等許多NAC轉(zhuǎn)錄因子N端的功能相似，能夠識(shí)別結(jié)合特定的靶基因序列、結(jié)合互作蛋白，但還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)證明［29］。多序列比對(duì)的結(jié)果表明，選取的20種植物中的NAC蛋白N端高度保守，推測(cè)這些轉(zhuǎn)錄因子可能具有相似的生物學(xué)功能。NAC蛋白的N端含有保守的NAC結(jié)構(gòu)域，典型的NAC結(jié)構(gòu)域又分為A-E 5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，不同的亞結(jié)構(gòu)域起著識(shí)別、結(jié)合DNA或蛋白質(zhì)的功能，在亞結(jié)構(gòu)域D中含有核定位信號(hào)，亞結(jié)構(gòu)域C是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，結(jié)合位點(diǎn)（WKATGTDK）在不同的NAC轉(zhuǎn)錄因子中高度保守［30］。而玉米NAC78與其在高粱、谷子、水稻、普通小麥、香蕉、毛果楊、木薯、棉花、馬鈴薯、番茄、煙草、獼猴桃、向日葵、黃瓜、擬南芥中的同源序列相應(yīng)位點(diǎn)為（WKATGKDR），第6和第8位的氨基酸殘基被堿性的賴氨酸（K）和精氨酸（R）替代，由此推測(cè)NAC78的靶基因與已知的擬南芥ANAC019等識(shí)別的DNA序列不同，或參與了植物中不同的調(diào)控途徑［31］。本試驗(yàn)以各個(gè)物種中NAC78同源序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，玉米與谷子、高粱、水稻、普通小麥和香蕉聚為一大支，并且與谷子的親緣關(guān)系最近。Pereira-Santana等［32］基于隱馬爾可夫模型（HMM）鑒定了24種陸生植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和NAC蛋白的分布，本試驗(yàn)得到的結(jié)果與其相似。

圖2 不同物種NAC78同源基因多序列比對(duì)Fig.2 Multiple sequence alignment of NAC78 homologous genes in different species

圖3 NAC78同源基因的進(jìn)化分析Fig.3 Evolutionary analysis of NAC78 homologous genes

圖4 NAC78在不同組織（A）及授粉后不同時(shí)期（B）胚乳中的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression of NAC78 in different tissues (A) and endosperm at different stages after pollination (B)

NAC78的表達(dá)具有組織特異性，對(duì)NAC78的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況的檢測(cè)表明，NAC78在玉米的各個(gè)組織中均有表達(dá)，在胚乳中的表達(dá)量顯著高于其他組織，由此可推知NAC78可能在胚乳發(fā)育的過(guò)程中起著重要的作用。NAC45/86是NAC78在擬南芥中的同源基因，Kaori等已證明NAC45/86在擬南芥篩管發(fā)育的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)對(duì)下游基因的調(diào)控使篩管分子的去核化過(guò)程正常進(jìn)行［33］。篩管的發(fā)育與胚乳的發(fā)育都是特殊的細(xì)胞程序化死亡（programmed cell death，PCD）現(xiàn)象，篩管分子在細(xì)胞核降解之后仍然行使運(yùn)輸物質(zhì)的功能［34-35］。同樣，玉米胚乳細(xì)胞核在授粉后15-20 d開始降解，無(wú)核的胚乳細(xì)胞仍然具有活性并開始大量積累淀粉蛋白質(zhì)，這一時(shí)期也是產(chǎn)量形成的重要階段［36-37］。NAC78在胚乳中的表達(dá)變化呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，授粉后15 d的相對(duì)表達(dá)量較第5天增加52.52倍，據(jù)此推測(cè)NAC78可能參與胚乳細(xì)胞PCD過(guò)程的調(diào)控，其具體生物的功能有待進(jìn)一步的深入研究。

表2 NAC78啟動(dòng)子中的順式作用元件Table 2 Cis-elements in the promoter of NAC78

圖5 ABA處理對(duì)玉米籽粒中NAC78表達(dá)的影響Fig.5 Effect of ABA treatment on NAC78 expression in maize kernel

ABA是一種重要的植物激素，在植物對(duì)逆境脅迫響應(yīng)、生長(zhǎng)發(fā)育等多個(gè)過(guò)程中起著重要的作用。ABA含量的增加能夠誘導(dǎo)多種基因表達(dá)量上調(diào)，施用外源ABA能夠增強(qiáng)植物對(duì)與干旱、低溫等多種非生物脅迫的抵抗能力［38］。另外，在對(duì)水稻、小麥、玉米的研究中發(fā)現(xiàn)，ABA能夠促進(jìn)籽粒灌漿以及光合同化產(chǎn)物向籽粒的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，使得產(chǎn)量增加［39-40］。前期的研究已發(fā)現(xiàn)多種轉(zhuǎn)錄因子能夠響應(yīng)ABA信號(hào)并調(diào)控植物的生命活動(dòng)［41］，擬南芥中的轉(zhuǎn)錄因子ABI4、ABI5能夠響應(yīng)ABA信號(hào)，進(jìn)而調(diào)控種子的發(fā)育以及淀粉的合成［42-43］。NAC78上游順式作用元件中含有7個(gè)AREB類的motif，AREB是響應(yīng)ABA的順式元件。為了探究NAC78的表達(dá)是否受到ABA的誘導(dǎo)，本試驗(yàn)使用ABA對(duì)玉米籽粒進(jìn)行處理。結(jié)果顯示，在ABA處理12 h后，NAC78的表達(dá)水平顯著上升，表明NAC78的表達(dá)受到ABA信號(hào)的誘導(dǎo)。后續(xù)的脅迫處理結(jié)果表明NAC78的表達(dá)也受到NaCl和PEG和誘導(dǎo)。自然狀態(tài)下，玉米灌漿期往往處于高溫干旱天氣，在這一條件下玉米需要多種復(fù)雜的機(jī)制調(diào)控自身適應(yīng)環(huán)境脅迫，由本試驗(yàn)結(jié)果可推測(cè)，NAC78可能通過(guò)參與ABA調(diào)控途徑影響相關(guān)基因的表達(dá)。

圖6 NaCl和PEG處理對(duì)葉片中NAC78表達(dá)的影響Fig.6 Effects of NaCl and PEG treatment on NAC78 expression in leaves

4 結(jié)論

本試驗(yàn)克隆得到了一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄因子NAC78，具有典型的NAM結(jié)構(gòu)域，屬于NAC轉(zhuǎn)錄因子家族。NAC78在胚乳中表達(dá)量顯著高于其他組織，推測(cè)其可能參與胚乳發(fā)育過(guò)程的調(diào)控。此外，ABA，NaCl和PEG均能夠誘導(dǎo)NAC78的表達(dá)，NAC78可能在玉米響應(yīng)和抵抗非生物脅迫的過(guò)程中發(fā)揮作用。