朱傳華，謝琳，劉安民

膠質(zhì)瘤是神經(jīng)中樞系統(tǒng)最常見的原發(fā)惡性腫瘤，且傳統(tǒng)手術(shù)、化療、放療及目前已有的靶向治療對膠質(zhì)瘤的治療效果不佳。目前對于膠質(zhì)瘤的病因仍不清楚，因此探討其發(fā)病機制對于膠質(zhì)瘤的診療具有重要意義［1］。蛋白二硫鍵異構(gòu)酶家族成員4（protein disulfide isomerase family a member 4，PDIA4）定位于細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)揮功能，參與蛋白質(zhì)折疊、硫醇-二硫鍵交換反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。近些年來越來越多研究表明，PDIA4基因是腫瘤診斷和治療的潛在靶標(biāo)［2］，但其在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制不明。本研究利用RNAi技術(shù)沉默PDIA4表達，探索其對膠質(zhì)瘤增殖和凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 研究對象

人膠質(zhì)瘤細胞系U251、U87、HA1800由中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心提供。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、細胞用青霉素/鏈霉素和EDTA胰酶購自美國Gibco公司；星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)基購自ScienCell公司；alarma blue試劑購于Sigma公司；LipofectamineTM3000、BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Invitrogen公司；RNA-Quick Purification Kit購自上海奕杉生物；cDNA Synthesis SuperMix和SYBR Green Master Mix購自上海翊圣生物；4%多聚甲醛、結(jié)晶紫染液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白提取RIPA裂解液購自康為世紀(jì)公司；cleaved-caspase-3、cleavedcaspase-7單克隆抗體、羊抗兔二抗購自CST公司。引物由蘇州泓迅生物科技公司合成，靶向PDIA4的小干擾RNA及陰性對照購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，siRNA序列：si-PDIA4#768 5′-GCAAGCGUUCUCCUCCAAUTT-3′，si-PDIA4#1829 5′-GCCUGGUCAUCGCCAAGAUTT-3′，siNC 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′。

1.2 CGGA數(shù)據(jù)庫分析

從CGGA（中國腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜計劃）網(wǎng) 站（http：//cgga.org.cn/）下 載mRNAseq_693［3］和mRNAseq_325［4］的RNAseq數(shù)據(jù)及相應(yīng)臨床數(shù)據(jù)，使用R語言的“sva”和“l(fā)imma”包進行批次校正，應(yīng)用kruskal檢驗分析基因表達量和腫瘤級別的相關(guān)性，利用“survival”和“survminer”u語言包進行生存分析并作圖，基因高表達組和低表達組通過中位值劃分。

1.3 細胞培養(yǎng)

將膠質(zhì)瘤細胞U87和U251與正常星形膠質(zhì)細胞HA1800于培養(yǎng)箱（37℃恒溫，5%CO2）中培養(yǎng)，U87和U251使用含100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，HA1800使用星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)基。每3 d消化傳代一次。

1.4 RT-qPCR法檢測膠質(zhì)瘤細胞的PDIA4表達

將各組細胞抽提總RNA，按試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA稀釋10倍后作為模板，以GAPDH為內(nèi)參，按照qPCR試劑說明書指示在BIO-RAD實時熒光定量PCR儀進行qPCR檢測。PCR引物序列：

qPCR反應(yīng)條件：95℃30 s；95℃5 s、60℃30 s，共40個循環(huán)。RT-qPCR的結(jié)果以2-△△Ct表示目的基因mRNA的相對表達量，△△Ct=（處理組Ct靶基因-處理組CtGAPDH）-（陰性對照組Ct靶基因-陰性對照組CtGAPDH）。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染

將5×104個/孔數(shù)目的細胞接種在6孔板上，待細胞融合度達到70%時，按照轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染細胞。將未轉(zhuǎn)染細胞、轉(zhuǎn)染siNC、轉(zhuǎn)染siPDIA4 768、轉(zhuǎn)染siPDIA4 1829的細胞分別稱為：空白組、陰性對照組、si#768組和si#1829組。

1.6 蛋白免疫印記實驗檢測細胞蛋白水平

收集各組轉(zhuǎn)染48 h后的細胞，使用RIPA裂解液冰上裂解15 min，離心后取上清使用BCA試劑盒蛋白定量，校準(zhǔn)蛋白濃度后與蛋白上樣緩沖液混勻于100℃孵育10 min，凝膠電泳后通過電泳轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加一抗（1∶1000）于4℃孵育過夜；TBST洗膜后加二抗（1∶5000）室溫孵育1 h，TBST洗膜后用ECL熒光發(fā)光試劑盒顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍攝分析，使用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.7 阿爾瑪藍（alarma blue）實驗檢測膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力

收集轉(zhuǎn)染8 h后的細胞，以2×103個/孔的細胞密度分別接種于96孔平底細胞培養(yǎng)板中。細胞分別繼續(xù)培養(yǎng)1 d、3 d、5 d后用每孔換alarma blue工作液100μL，37℃細胞培養(yǎng)箱孵育1 h后，在酶標(biāo)儀上檢測吸收波長530 nm，發(fā)射波長590 nm的熒光強度。

1.8 克隆形成實驗檢測細胞克隆集落形成數(shù)目

收集轉(zhuǎn)染8 h后的細胞，以2×103個/孔的細胞密度分別接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，細胞培養(yǎng)14 d后，4%多聚甲醛溶液固定15 min，500μL結(jié)晶紫染液染色15 min，清洗烘干后拍照計數(shù)。

1.9 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率

各組細胞轉(zhuǎn)染24 h后換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，收集細胞和上清，PBS重懸后離心收集細胞，用含5μL Annexin V-FITC和10μL PI染料的凋亡染色緩沖液重懸細胞，室溫避光孵育20 min，流式上機檢測FITC和PI通道相應(yīng)的信號值。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

以上所有實驗均重復(fù)3次。使用Graphpad Prism 8.0及SPSS 25.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和圖片繪圖。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較用單因素方差分析，兩組之間比較采用t檢驗，生存分析應(yīng)用Log-rank檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CGGA數(shù)據(jù)分析驗證PDIA4基因與膠質(zhì)瘤級別和不良預(yù)后相關(guān)

PDIA4表達水平在WHOⅡ-Ⅳ級膠質(zhì)瘤中分別為4.37±0.77、4.80±0.83和5.60±0.94，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=140.58，P＜0.05），kruskal檢驗分析PDIA4表達量和膠質(zhì)瘤級別的具有相關(guān)性（P＜0.05）。用LSD-t法進行兩兩比較WHOⅡ級與WHOⅢ級相比、WHOⅢ級與WHOⅣ相比（均P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖1A）。Kaplan-Meier生存分析PDIA4高表達組5年生存率16.23%，PDIA4低表達組60.20%，Log-rank檢驗（Log-rank=264.32，P＜0.001），兩組生存差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖1B）。

圖1 CGGA膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)中PDIA4的表達水平與膠質(zhì)瘤級別和總體生存期的關(guān)系 A：各級別膠質(zhì)瘤PDIA4的表達水平；B：PDIA4高表達和低表達組的總生存曲線

2.2 在膠質(zhì)瘤細胞系中驗證PDIA4表達差異

膠質(zhì)瘤細胞株U251和U87相對于正常星形膠質(zhì)細胞株HA1800的2-△△Ct值分別是3.03±0.38和1.87±8.35，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=58.44，P＜0.05）。多重比較顯示，U251和U87的PDIA4表達水平均高于HA1800（均P＜0.05），且U251要高于U87（P＜0.05），故選擇U251進行后續(xù)實驗。

2.3 PDIA4沉默效果驗證

相比于空白組和陰性對照組，si#768組和si#1829組細胞PDIA4蛋白表達量降低（F=92.63，P＜0.001）（圖2，表1），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。多重比較顯示si#768組和si#1829組的PDIA4蛋白表達量均低于空白組和對照組（均P＜0.001），且si#768組和si#1829組之間，空白組和陰性對照組之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

圖2 蛋白免疫印記實驗檢測siRNA沉默效果

表1 PDIA4在細胞株中敲降效果驗證（n=3）

2.4 沉默PDIA4抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖

si#768組和si#1829組細胞增殖速度均低于空白組和陰性對照組（圖3），第5d各組的熒光強度：空白組（300.00±4.53）、陰性對照組（282.33±2.71）、si#768組（108.67±8.45）、si#1829組（42.00±.0.65）（F=487.59，P＜0.01）。多重比較顯示si#768組和si#1829組的熒光強度均低于空白組和對照組（均P＜0.01），且空白組和陰性對照組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），si#768組和si#1829組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 沉默PDIA4抑制膠質(zhì)瘤細胞克隆集落形成

si#768組（158.00±55.15）和si#1829組（110.50±11.92）的克隆集落形成數(shù)目明顯低于空白組（393.00±96.15）和陰性對照組（382.50±82.84）（F=49.34，P＜0.05），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖4A，B）。多重比較顯示si#768組和si#1829組的克隆集落形成數(shù)目均低于空白組和對照組（均P＜0.001），且si#768組和si#1829組之間，空白組和陰性對照組之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

圖3 阿爾瑪藍實驗檢測各組細胞的增殖水平 與空白組和陰性對照組比較，**P＜0.01，***P＜0.001）

2.6 沉默PDIA4促進膠質(zhì)瘤細胞凋亡

空白組、陰性對照組、si#768組和si#1829組凋亡率分別為（3.72±7.11）%、（6.53±0.13）%、（7.67±0.11）%、（19.50±9.30）%，si#768組和si#1829組細胞凋亡比例高于空白組和陰性對照組（F=51.06，P＜0.05），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖5）。多重比較顯示si#768組和si#1829組的細胞凋亡比例均高于空白組和對照組（均P＜0.05），且si#768組和si#1829組之間，空白組和陰性對照組之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

圖4 克隆形成實驗檢測各組細胞克隆形成能力 A：各組細胞克隆集落掃描圖；B：各組細胞克隆形成集落計數(shù)統(tǒng)計圖（mean±SD，n=3，**與空白組和陰性對照組比較，P＜0.01，***與空白組和陰性對照組比較，P＜0.001）

圖5 流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況

2.7 沉默PDIA4后Caspase通路激活

相比于陰性對照組，si#768組和si#1829組cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 7表達量均有升高（圖6，表2），cleaved-caspase 3表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=19.58，P＜0.05），cleaved-caspase7表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=12.61，P＜0.05）。多重比較顯示，si#768組和si#1829組cleaved-caspase 3和cleaved-caspase 7表達水平均高于陰性對照組（均P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖6 蛋白免疫印跡實驗檢測各組細胞凋亡相關(guān)蛋白表達情況

表2 不同處理組凋亡相關(guān)蛋白相對表達量（n=3）

3 討論

本研究分析CGGA數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)PDIA4表達水平膠質(zhì)瘤級別相關(guān)，且其表達水平越高，患者預(yù)后越差，這與先前研究報道的結(jié)果相符［5］。膠質(zhì)瘤的發(fā)生是一個多因素參與的病理過程，因其分子機制多樣性［6］，導(dǎo)致治療和預(yù)后不理想。作為在多種腫瘤中均高表達的蛋白，PDIA4能發(fā)揮分子伴侶的功能［7］，促進蛋白質(zhì)合成，這恰是腫瘤細胞快速增殖所需要的，提示PDIA4在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中可能具有重要作用。后續(xù)實驗發(fā)現(xiàn)PDIA4在膠質(zhì)瘤細胞中高表達，表明PDIA4可能是膠質(zhì)瘤的特異性分子標(biāo)記物。

進一步研究PDIA4在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮的功能，通過siRNA沉默膠質(zhì)瘤細胞的PDIA4表達后，觀察到細胞增殖減慢，Yao等［8］在卵巢癌研究發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象，表明PDIA4高表達是膠質(zhì)瘤細胞快速增殖所需要的。有研究證實PDIA4是前列腺癌細胞凋亡的負調(diào)控因子［9］，我們的研究發(fā)現(xiàn)沉默PDIA4的膠質(zhì)瘤細胞凋亡比例升高，這提示PDIA4可能也參與了膠質(zhì)瘤細胞凋亡進程。

細胞凋亡是細胞在多種基因調(diào)控下，用于維持細胞穩(wěn)態(tài)的程序性自殺模式［10］。為進一步探索下游機制，檢測發(fā)現(xiàn)實驗組的cleaved-caspase 3、cleavedcaspase 7表達均有升高，而caspase 3和caspase 7是經(jīng)典凋亡通路的觀察指標(biāo)，作為細胞凋亡的主要執(zhí)行者，需要通過蛋白水解形成剪切體發(fā)揮功能，啟動細胞凋亡。由此推測，沉默PDIA4可能通過激活caspase通路來促進膠質(zhì)瘤細胞凋亡。

綜上所述，沉默PDIA4可以明顯抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖，促進細胞凋亡，其機制可能是通過激活caspase通路，但是對于否有其他信號通路參與仍需要進行更深入的研究。同時本研究仍存在明顯的不足：首先實驗僅進行了沉默PDIA4，沒有進行過表達實驗，也未在正常膠質(zhì)細胞中進行實驗，難以明確基因基本功能；其次，僅在數(shù)據(jù)庫和細胞水平對該基因進行功能探索，缺少確實的臨床數(shù)據(jù)和動物實驗，未來的研究需要對其進一步的完善。