譚梓聰，張洋璠，黃曉燕，楊浩杰，曹銘輝*

乳腺癌是目前全世界發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其死亡率在世界范圍排名第五位［1］。近年來不少針對(duì)乳腺癌治療的研究都把關(guān)注點(diǎn)放在乳腺癌的轉(zhuǎn)移方面，因?yàn)槿橄侔┑霓D(zhuǎn)移和患者的生存期密切相關(guān)，乳腺癌的轉(zhuǎn)移會(huì)加大治療的難度，不利于延長患者的生存期［2，3］。因此，闡明乳腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制對(duì)治療乳腺癌至關(guān)重要。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是黏附性的上皮細(xì)胞相互分離并轉(zhuǎn)化為單個(gè)遷移性細(xì)胞的過程，是腫瘤發(fā)生局部侵犯和向遠(yuǎn)隔器官播散的關(guān)鍵步驟［4，5］。此外，EMT也與腫瘤的耐藥和免疫抑制微環(huán)境的維持有關(guān)［6，7］。因此，EMT在包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤的進(jìn)展中起著重要作用［8］。TGF-β1是EMT的主要誘導(dǎo)因子之一，在癌癥進(jìn)展、遷移、侵襲中發(fā)揮關(guān)鍵作用，TGF-β信號(hào)通路被視為腫瘤EMT進(jìn)展的關(guān)鍵通路之一［9］。已有研究表明TGF-β信號(hào)通路在乳腺癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用，與乳腺癌的EMT進(jìn)展息息相關(guān)［10］。除此之外，近年越來越多研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的非編碼RNA能通過TGF-β通路調(diào)控細(xì)胞EMT過程，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，在乳腺癌中也有相關(guān)報(bào)道［11，12］。

長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNAs，LncRNAs）是指長度大于200 nt、參與多種生物學(xué)功能的不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子［13，14］。LncRNAs能通過多種手段發(fā)揮生物學(xué)功能，例如，lncRNA LETN與NPM1蛋白直接結(jié)合在核仁里調(diào)控細(xì)胞增殖，Linc-SCRG1能作為microRNA miR26a的ceRNA加快腫瘤增殖，LINC00665甚至能編碼肽段來影響三陰乳腺癌的進(jìn)展［15-17］。Lnc-TSI在腎癌和腎臟纖維化中被報(bào)道TGF-β信號(hào)通路密切相關(guān)，在TGF-β信號(hào)通路介導(dǎo)的腎癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，但是Lnc-TSI在乳腺癌中的作用尚未被報(bào)道［18，19］。

本研究著重探討了Lnc-TSI和TGF-β1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MCF-7和BT474轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)TGF-β1誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7和BT474發(fā)生EMT的同時(shí)上調(diào)Lnc-TSI水平，敲除和過表達(dá)Lnc-TSI分別促進(jìn)和抑制TGF-β1介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞MCF-7和BT474轉(zhuǎn)移。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 MCF-7和BT474購于ATCC。

1.1.2 試劑細(xì)胞因子 TGF-β1購于培譜生物公司。E-cadherin、N-cadherin和Vimentin抗體購于CST公司。Lnc-TSI引物購于艾基公司。反轉(zhuǎn)錄試劑購于瑞真公司。RNA熒光定量試劑購于Takara公司。CRISPR-Cas 9敲除Lnc-TSI的慢病毒和過表達(dá)Lnc-TSI的慢病毒由南方醫(yī)科大學(xué)王鵬博士贈(zèng)予。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞 MCF-7和BT474均在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中添加濃度100 U/mg的青霉素和濃度100 mg/mL的鏈霉素。細(xì)胞均在條件設(shè)定為37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。TGF-β1處理無特殊說明均為10 ng/mL濃度的TGF-β1連續(xù)刺激72 h。

1.2.2 Western blot 使用添加1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑的RIPA試劑冰上裂解細(xì)胞，裂解完全后在12 000 r/min速度下4℃離心30 min，用分光光度計(jì)測(cè)定濃度后在95℃下加熱5 min使蛋白完全變性。變性后的蛋白樣品在SDS-PAGE凝膠系統(tǒng)中電泳，然后使用甲醇激活的0.45μm PVDF膜轉(zhuǎn)膜，按抗體說明書孵育相應(yīng)一抗、二抗，在檢測(cè)化學(xué)發(fā)光的顯影儀器中顯影。

1.2.3 qRT-PCR 細(xì)胞的總RNA通過TRIZOL提取，在Roche 480平臺(tái)上按照說明書使用逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量擴(kuò)增試劑檢測(cè)Lnc-TSI表達(dá)水平。Lnc-TSI引 物 序 列 為Forward：5′AATCTGGTGTGGACAAACGC3′，Reverse：5′AACAGATGCTTCCGAATGCC3′。

1.2.4 CRISPR-Cas9 為了利用CRISPR-Cas9基因編輯構(gòu)建敲除Lnc-TSI的細(xì)胞，兩個(gè)靶向Lnc-TSI的sgRNA被克隆到U6-multiple（sgRNA）-SV40-EGFP載體中。表達(dá)Cas9的載體為Lenti-Cas9-Puro載體。靶向Lnc-TSI的第一個(gè)CRISPR-Cas9系統(tǒng)兩個(gè)sgRNA序列如下：sgRNA1，5′TTCCAGCCAGG TATCAGAGT3′，sgRNA2，5′CACTGTGGGCATCTCAACCC3′。靶向Lnc-TSI的第二個(gè)CRISPR-Cas9系統(tǒng)兩個(gè)sgRNA序列如下：sgRNA1，5′GAGCTAATGCTGGTGCCGTG3′；sgRNA2，5′GGCTGTCGAGGCTGCAGCGA3′。根據(jù)說明書對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行sgRNA慢病毒和Cas9慢病毒的共轉(zhuǎn)染。

1.2.5 過表達(dá)Lnc-TSI 用PCR技術(shù)擴(kuò)增Lnc-TSI的全長cDNA并克隆到pCDH-EF1-MCS-Puro載體中，由此合成過表達(dá)質(zhì)粒?？蛰d的pCDH-EF1-MCSPuro載體和pCDH-EF1-MCS-Puro-lnc-TSI過表達(dá)載體在含有pMD2.BSBG和PSPAX2質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞中包裝成慢病毒。按轉(zhuǎn)染慢病毒試劑的說明書給細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒，并且在轉(zhuǎn)染后72 h用嘌呤霉素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選。

1.2.6 遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn) 遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)在transwell上室加入含有1×105個(gè)細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基細(xì)胞懸液。TGF-β1處理組的上室細(xì)胞懸液中含有濃度為10 ng/mL的TGF-β1，PBS處理組的上室細(xì)胞懸液中含有與TGF-β1相同體積的PBS。Transwell下室添加含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基。上下室共同孵育8 h后將細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定15 min，用0.1%結(jié)晶紫染色15 min。在顯微鏡下的五個(gè)隨機(jī)視野中對(duì)穿透膜的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。行侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)把transwell上室用50 mL基質(zhì)膠4℃包被過夜，其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用IBMSPSSstatistics 25對(duì)本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，qRT-PCR和transwell實(shí)驗(yàn)的組間對(duì)比選用t檢驗(yàn)。結(jié)果的P值若小于0.05則被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7和BT474發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

首先建立TGF-β1誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7和BT474發(fā)生EMT的細(xì)胞模型。在10 ng/mL TGF-β1處理后72 h后，乳腺癌細(xì)胞MCF-7和BT474的形態(tài)對(duì)比PBS處理組從類圓形向梭形改變（圖1-A），western blot結(jié)果顯示細(xì)胞中的EMT相關(guān)蛋白Ecadherin下調(diào)，N-cadherin和Vimentin上調(diào)，并且隨著處理時(shí)間的增加蛋白水平變化程度加大（圖1-B）。Transwell實(shí)驗(yàn)說明TGF-β1處理過后的乳腺癌細(xì)胞MCF-7和BT474侵襲能力增強(qiáng)（圖1-C，1-D）。這說明MCF-7和BT474在TGF-β1刺激下發(fā)生EMT改變。

圖1 TGF-β1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MCF-7和BT474的轉(zhuǎn)移 A：用TGF-β1（10 ng/mL）處理MCF-7和BT474細(xì)胞72 h后，對(duì)比PBS處理組，細(xì)胞形態(tài)明顯拉長呈紡錘形；B：用TGF-β1（10 ng/mL）處理MCF-7和BT474細(xì)胞0、24、48、72 h后，western blot檢測(cè)細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin水平；C：Transwell檢測(cè)用TGF-β1（10 ng/mL）處理MCF-7和BT474細(xì)胞72 h后對(duì)比PBS處理組細(xì)胞侵襲數(shù)目；D：統(tǒng)計(jì)transwell實(shí)驗(yàn)的結(jié)果（**與PBS組相比P＜0.01）

2.2 TGF-β1上調(diào)乳腺癌細(xì)胞MCF-7和BT474中的Lnc-TSI表達(dá)

TGF-β1誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞EMT細(xì)胞模型建立以后，要利用這一細(xì)胞模型探究Lnc-TSI在其中發(fā)揮的作用。首先我們研究了Lnc-TSI在乳腺癌細(xì)胞EMT過程中表達(dá)量是否發(fā)生變化。在沒有TGF-β1刺激的條件下，對(duì)比正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A，乳腺癌細(xì)胞MCF-7和BT474中的Lnc-TSI水平更高（圖2-A），而TGF-β1處理能顯著上調(diào)乳腺癌細(xì)胞MCF-7和BT474中的Lnc-TSI表達(dá)（圖2-A）。在證實(shí)乳腺癌細(xì)胞EMT過程中Lnc-TSI表達(dá)上調(diào)后，通過敲除和過表達(dá)來探究Lnc-TSI在這個(gè)細(xì)胞模型中的功能。在乳腺癌細(xì)胞MCF-7和BT474中敲除Lnc-TSI，發(fā)現(xiàn)Lnc-TSI表達(dá)顯著下調(diào)（圖2-B）。在乳腺癌細(xì)胞MCF-7和BT474中過表達(dá)Lnc-TSI后，Lnc-TSI表達(dá)顯著上調(diào)（圖2-C）。

圖2 Lnc-TSI在TGF-β1介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞EMT中上調(diào) A：qRT-PCR檢測(cè)正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A和TGF-β1處理后乳腺癌細(xì)胞MCF-7、BT474的Lnc-TSI表達(dá)水平（***與PBS組相比P＜0.001）；B：qRT-PCR檢測(cè)敲除Lnc-TSI后乳腺癌細(xì)胞MCF-7、BT474中的Lnc-TSI表達(dá)水平（**與PBS組相比P＜0.01）；C：qRT-PCR檢測(cè)過表達(dá)Lnc-TSI后乳腺癌細(xì)胞MCF-7、BT474中的Lnc-TSI表達(dá)水平（***與PBS組相比P＜0.001）

2.3 Lnc-TSI抑制TGF-β1介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞MCF-7和BT474轉(zhuǎn)移

上述實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明乳腺癌細(xì)胞MCF-7和BT474中敲除和過表達(dá)Lnc-TSI的效率，在此基礎(chǔ)上通過transwell實(shí)驗(yàn)探究Lnc-TSI表達(dá)的改變?cè)赥GF-β1介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞EMT模型中是否會(huì)引起表型的變化。敲除乳腺癌細(xì)胞MCF-7和BT474的Lnc-TSI后，在沒有TGF-β1刺激的條件下，MCF-7和BT474細(xì)胞的侵襲遷移數(shù)目明顯增加，這個(gè)現(xiàn)象在TGF-β1處理后的EMT模型中更加明顯（圖3-A）。相反，過表達(dá)Lnc-TSI能顯著降低MCF-7和BT474細(xì)胞的侵襲遷移數(shù)目，在TGF-β1處理的EMT模型中更加明顯（圖3-B）。由此證實(shí)了在TGF-β1介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞EMT模型中改變Lnc-TSI的表達(dá)能引起侵襲遷移表型的改變，Lnc-TSI能抑制TGF-β1介導(dǎo)的乳腺癌轉(zhuǎn)移。

3 討論

乳腺癌是常見于女性的惡性腫瘤，其轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未被完全闡述清楚。已有研究報(bào)道TGF-β信號(hào)通路在乳腺癌的EMT進(jìn)展中起重要作用［10］。TGF-β1是激活TGF-β信號(hào)通路的關(guān)鍵分子之一，因此，本研究選擇使用TGF-β1作為構(gòu)建乳腺癌EMT細(xì)胞模型的刺激分子［18］。Lnc-TSI在腎癌中已經(jīng)被報(bào)道能通過TGF-β信號(hào)通路調(diào)控腎癌細(xì)胞EMT進(jìn)展，最終影響腎癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。但乳腺癌的轉(zhuǎn)移與Lnc-TSI的相關(guān)性尚未被報(bào)道［19］?；谏鲜龌A(chǔ)，本研究在使用TGF-β1構(gòu)建的乳腺癌細(xì)胞EMT模型中探究了Lnc-TSI與乳腺癌轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。

為了說明TGF-β1能成功構(gòu)建乳腺癌細(xì)胞EMT模型，本研究使用10 ng/mL的TGF-β1處理乳腺癌細(xì)胞MCF-7和BT474 72 h。從細(xì)胞形態(tài)的梭形改變，western blot檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白E-cadherin下調(diào)和N-cadherin、Vimentin上調(diào)，細(xì)胞侵襲數(shù)目增加三個(gè)方面證實(shí)MCF-7和BT474細(xì)胞發(fā)生EMT改變。在乳腺癌EMT細(xì)胞模型構(gòu)建成功的前提下，實(shí)驗(yàn)證實(shí)Lnc-TSI的表達(dá)在TGF-β1介導(dǎo)的EMT過程中上調(diào)，說明TGF-β信號(hào)通路的激活會(huì)導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞MCF-7和BT474中Lnc-TSI水平升高，Lnc-TSI和TGF-β信號(hào)通路之間存在相關(guān)性。為了進(jìn)一步探究Lnc-TSI是否能通過調(diào)控TGF-β信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的侵襲遷移表型產(chǎn)生影響，在MCF-7和BT474細(xì)胞中分別敲除和過表達(dá)Lnc-TSI，transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲除和過表達(dá)Lnc-TSI會(huì)分別增加和減少乳腺癌細(xì)胞MCF-7和BT474的侵襲遷移數(shù)目，在TGF-β1處理72 h后的MCF-7和BT474細(xì)胞中這個(gè)現(xiàn)象會(huì)更加明顯，這反映了Lnc-TSI能抑制腺癌細(xì)胞MCF-7和BT474的EMT進(jìn)程，而這種作用很大程度上又依賴于TGF-β1刺激活化的TGF-β信號(hào)通路。Lnc-TSI通過TGF-β信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)了對(duì)乳腺癌MCF-7和BT474的EMT和侵襲遷移的調(diào)控。然而，本研究尚未揭示Lnc-TSI與TGF-β信號(hào)通路之間的分子聯(lián)系，Lnc-TSI在乳腺癌中影響TGF-β信號(hào)通路的分子機(jī)制是否與在腎癌中報(bào)道的抑制，這些問題都將是我們下一步研究的關(guān)鍵。

研究普遍認(rèn)為TGF-β1介導(dǎo)的EMT與smad蛋白家族有關(guān)，TGF-β1結(jié)合TGF-β受體激活胞內(nèi)段激酶磷酸化smad2和smad3蛋白，磷酸化的smad2和smad3與smad4結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體，入核通過調(diào)控下游靶基因的表達(dá)介導(dǎo)細(xì)胞的EMT進(jìn)程［20］。然而，TGF-β1還能通過多種其他途徑調(diào)控EMT，比如MAPK通路和PI3K/AKT通路等［21］。本研究證明了長鏈非編碼RNA Lnc-TSI與參與了TGF-β1對(duì)EMT的調(diào)控，說明非編碼RNA在TGF-β1信號(hào)通路中也能發(fā)揮重要的作用。然而，包括Lnc-TSI在內(nèi)的非編碼RNA是否能跟通路其他下游蛋白產(chǎn)生聯(lián)系？這個(gè)問題尚有待我們探究。

綜上所述，Lnc-TSI在TGF-β1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MCF-7和BT474的侵襲遷移的過程中表達(dá)上調(diào)，Lnc-TSI能抑制TGF-β1介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞MCF-7和BT474的侵襲遷移的增加。