晁琳珂 王恩瑩 李鴿 郝素曉 趙藝清 盧艷芬 姚允聰

摘要?[目的]研究SnRK2基因在調(diào)控非生物脅迫方面的生物學(xué)功能。[方法]從蘋果矮化中間砧“SH6”中分離得到3種SnRK2基因，運(yùn)用多種生物學(xué)工具分析其序列特征。[結(jié)果]序列分析表明，SnRK2的CDS序列長(zhǎng)度：SnRK2.6為956 bp，SnRK2.7為1 013 bp，SnRK2.8為1 072 bp，分別編碼318、337和357個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì);SnRK2蛋白無(wú)明顯的疏水性，主要定位于細(xì)胞質(zhì);3種SnRK2序列相似性較高，都具有PKc_like超級(jí)家族和S_TKc家族特有的結(jié)構(gòu)。[結(jié)論]這3種SnRK2基因可能在蘋果非生物脅迫方面發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞?“SH6”;SnRK2;非生物脅迫;基因克隆;序列分析

中圖分類號(hào)?Q943.2?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A?文章編號(hào)?0517-6611（2021）09-0098-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.09.025

Abstract?[Objective] To study the biological function of SnRK2 ?in regulating abiotic stress. [Method] Three SnRK2 genes were isolated from the “SH6” dwarf interstock?of Malus， and their sequence characteristics were analyzed by various biological tools. [Result]?The sequence analysis showed that the sequence length of SnRK2 was SnRK2.6 956 bp， SnRK2.7 1013 bp， SnRK2.8 1072 bp， encoding 318， 337 and 357 amino acids respectively;SnRK2 protein had no obvious hydrophobicity， and mainly located in the cytoplasm;three SnRK2 sequences had high similarity， and all had PKc_like super family and S_TKc family unique structures. [Conclusion] Three SnRK2 genes could play important role in abiotic stress of Malus.

Key words?“SH6”;SnRK2;Abiotic stress;Gene cloning;Sequence analysis

蔗糖非酵解型蛋白激酶（sucrose non-fermenting1-related protein kinase，SnRK）是植物糖信號(hào)傳導(dǎo)、脅迫、種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的關(guān)鍵開關(guān)，廣泛分布于植物體內(nèi)的蛋白激酶[1]，屬 Ser/Thr 類蛋白激酶，參與多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，對(duì)植物的抗逆境生理起到至關(guān)重要的作用[2]。SnRK1亞家族第1個(gè)報(bào)道的植物SNF1相關(guān)序列是RKIN1，一個(gè)從黑麥胚乳cDNA文庫(kù)中分離出來(lái)的cDNA[3]。RKIN1編碼一個(gè)含502個(gè)氨基酸殘基（57710 DA）的蛋白，與SNF1和AMPK的氨基酸序列同源性為48%。RKIN1蛋白激酶的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)也類似于SNF1和AMPK，其催化結(jié)構(gòu)域在N端半端[4]。另外，從擬南芥中克隆出10個(gè)SnRK2（SnRK2.1～ SnRK2.10）成員，5個(gè)受ABA誘導(dǎo)，9個(gè)受NaCl脅迫誘導(dǎo)，所有成員均不受低溫誘導(dǎo)[5]。有研究表明，在水稻中，10個(gè)SnRK2成員（SAPK1～SAPK10）不同程度響應(yīng)滲透脅迫應(yīng)答，其中3個(gè)成員響應(yīng)ABA脅迫誘導(dǎo)[6]。在大豆中發(fā)現(xiàn)4個(gè)SnRK2成員，GmSPK1、 GmSPK2、GmSPK3 、GmSPK4都受高滲脅迫誘導(dǎo)，其中SPK3還響應(yīng)外源ABA處理[7]。之后相繼從玉米中發(fā)現(xiàn)11個(gè)SnRK2基因家族成員，其中2個(gè)受NaCl誘導(dǎo)，2個(gè)受低溫誘導(dǎo)，3個(gè)在轉(zhuǎn)錄水平受熱處理被抑制[8]。蘋果SnRK2基因家族鑒定出12個(gè)SnRK2蛋白序列。作為植物獨(dú)有的一類蛋白激酶，SnRK2 家族成員與植物抗性密切相關(guān)，提高植物抗性的主要原因是SnRK2基因的過量表達(dá)，啟動(dòng)了下游一系列與抗性相關(guān)基因的大量表達(dá)[9]。

“SH6”（Malus sp.SH6）是山西省果樹研究所將“武鄉(xiāng)海棠”和“國(guó)光”的雜交后代經(jīng)選育得到的經(jīng)濟(jì)性狀和綜合抗性都較為優(yōu)秀的蘋果中半矮化中間砧木品種，其本身抗旱、抗凍、抗抽條，嫁接親和能力強(qiáng)，適用范圍廣，利用其作為砧木的果樹樹勢(shì)緩和，主栽于山西、河北、北京等北方地區(qū)。目前，利用矮化中間砧是達(dá)到矮化密植栽培的主要途徑，而干旱、鹽害等環(huán)境脅迫均有可能造成其作為中間砧木生理功能正常發(fā)揮的障礙，因此了解SnRK2基因調(diào)控下半矮化中間砧“SH6”在非生物脅迫方面的變化，對(duì)于進(jìn)一步提高其抗逆性，優(yōu)化產(chǎn)量與品質(zhì)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1?材料與方法

1.1?材料

以蘋果屬植物“SH6”（Malus sp.SH6）為試材，自山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所（太谷）（112.51°E，37.35°N）采樣，選取植物葉片進(jìn)行試驗(yàn)。采樣后迅速放入液氮中，之后于-80 ℃凍存。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?蘋果屬植物SnRK2的克隆。

RNA的提?。悍Q取0.1 g凍存于-80 ℃的植物葉片，參考EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（艾德萊，中國(guó)）進(jìn)行葉片總RNA提取。

第1鏈cDNA的合成：利用cDNA合成試劑盒（Takara，日本）將提取的植物葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。

引物的設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）公布的蘋果同源基因MdSnRK2.6（GenBank：AII82270）、MdSnRK2.7（GenBank：AII82271）、MdSnRK2.8（GenBank：AII82272），利用NCBI Primer Designing Tool工具設(shè)計(jì)引物，序列見表1。

PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系（50 μL）：水，22 μL;2×EASYPfu PCR SuperMix（全式金，北京），25 μL;SnRK2-F（10 μmol/L），1 μL;SnRK2-R（10 μmol/L），1 μL;新合成的cDNA，1 μL。

PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系與條件：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 4.5 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 7 min;4 ℃ 保存。

PCR產(chǎn)物純化回收后，連接pEASY-Blunt Cloning Vector（全式金，北京）并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Trans T1感受態(tài)細(xì)胞（全式金，北京），進(jìn)行轉(zhuǎn)化子鑒定后，選取5個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2?SnRK2的生物信息學(xué)分析。

利用Compute PI/Mw計(jì)算基因的理化性質(zhì)，如等電點(diǎn)和分子質(zhì)量等信息;利用ProtScale預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)的疏水性功能;利用SWISS-MODEL預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu);利用NCBI Conserved Domain Search Service 分析其蛋白質(zhì)保守功能域;利用MEME工具對(duì)其蛋白質(zhì)序列進(jìn)行保守基序分析;利用DNAMAN 7.0對(duì)檢索到的相關(guān)基因的氨基酸序列進(jìn)行相似性分析;利用MEGA 5.05工具進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.2.3?干旱脅迫下蘋果屬SnRK2基因的表達(dá)分析。

在“SH6”組培苗正常生長(zhǎng)至3葉期，對(duì)其進(jìn)行干旱處理。干旱處理：正常的MS培養(yǎng)基中，加入10% PEG 6000模擬干旱環(huán)境。處理后20 d取樣，用于基因表達(dá)分析。使用多糖多酚植物RNA提取試劑盒提取蘋果屬植物“SH6”葉片的RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用CFX96TM Real Time PCR System進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)，反應(yīng)體系為 2×SYBR Green qPCR Mix，10 μL;Primer-F，1 μL;Primer-R，1 μL;cDNA，2 μL;ddH2O，8 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)。取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，并進(jìn)行3次獨(dú)立試驗(yàn)。使用2Δ-11Ct分析方法計(jì)算基因表達(dá)的差異[10]，使用Malus 18S核糖體RNA基因作為內(nèi)參基因的相對(duì)定量來(lái)測(cè)定轉(zhuǎn)錄水平。

2?結(jié)果與分析

2.1?“SH6”植物葉片SnRK2基因的克隆

利用植物RNA快速提取試劑盒提取葉片RNA并進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，結(jié)果如圖1a所示，采用同源克隆的方法，克隆得到“SH6”中3種SnRK2基因的CDS（Coding sequence）序列（圖1b）。測(cè)序結(jié)果分析表明，“SH6”中SnRK2基因的CDS序列全長(zhǎng)分別為SnRK2.6為956 bp，SnRK2.7為1 013 bp，SnRK2.8為1 072 bp，分別編碼318、337和357個(gè)氨基酸。

2.2?蘋果屬植物“SH6”的SnRK2序列

將克隆得到的“SH6”的SnRK2基因CDS序列利用DNAMAN軟件進(jìn)行同源性分析（圖2），結(jié)果表明，“SH6”的3種SnRK2基因SnRK2.6、SnRK2.7和SnRK2.8的同源性為72.07%。

利用DNA Star SeqMan軟件進(jìn)行氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，蘋果屬植物“SH6”中SnRK2.6、SnRK2.7和SnRK2.8分別編碼318、337、357個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。進(jìn)一步用Compute PI/Mw工具推測(cè)其氨基酸信息發(fā)現(xiàn)，SnRK2.6的等電點(diǎn)是5.48，表觀分子量為38.44 kDa;SnRK2.7的等電點(diǎn)是6.25，表觀分子量為40.21 kDa;SnRK2.8的等電點(diǎn)是4.73，表觀分子量為40.72 kDa。用DNAMAN軟件將克隆得到的3種“SH6”的SnRK2基因的核酸序列進(jìn)行相似性分析（圖2），發(fā)現(xiàn)它們核酸序列的相似性達(dá)72.07%;利用NCBI Conserved Domain Search service工具對(duì)SnRK2編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在“SH6”中SnRK蛋白序列N-端氨基酸區(qū)域含有S_TKc和PKc_like超級(jí)家族結(jié)構(gòu)域（圖3）。

2.3?SnRK2蛋白信息分析結(jié)果

利用ProtScale工具預(yù)測(cè)SnRK2蛋白質(zhì)疏水性功能，SnRK2.6的平均疏水性是-0.613，SnRK2.7為-0.713，SnRK2.8為-0.748，均無(wú)明顯的疏水性。通過MEME對(duì)SnRK2蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果表明，3種SnRK2蛋白中各有6個(gè)高度保守的基序（圖4）。利用Psort工具預(yù)測(cè)SnRK2蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位信息，發(fā)現(xiàn)SnRK2.6蛋白可能分布于過氧化物酶體（4.3%）、液泡（4.3%）、線粒體（4.3%）、質(zhì)膜（4.3%）、細(xì)胞質(zhì)（73.9%）、細(xì)胞核（8.7%）;SnRK2.7可能分布于線粒體（8.7%）、高爾基體（4.3%）、細(xì)胞質(zhì)（52.2%）、細(xì)胞核（34.8%）;而SnRK2.8可能分布于線粒體（13.0%）、質(zhì)膜（4.3%）、液泡（4.3%）、細(xì)胞質(zhì)（56.5%）、細(xì)胞核（21.7%），這表明這些蛋白可能主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。進(jìn)一步用SWISS-MODEL推測(cè)SnRK2的蛋白質(zhì)3級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5所示，這些蛋白激酶主要由 α- 螺旋、 無(wú)規(guī)則卷曲、 延伸鏈和 β- 轉(zhuǎn)角構(gòu)成，與2級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。此外，SnRK2.6蛋白激酶的3級(jí)結(jié)構(gòu)與SnRK2.7 蛋白激酶極為相似，推測(cè)它們具有類似功能。

2.4?系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果分析

利用MEGA 5.05軟件中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，比對(duì)克隆得到的蘋果屬植物SnRK2蛋白與NCBI中檢索到的18種其他物種的SnRK同源蛋白，如玉米的SnRK2.6蛋白（GenBank：ACG500100）、陸地棉的SnRK2.6蛋白（GenBank：AFH96416）、煙草的SnRK2.6蛋白（GenBank：ACQ42253）、玉米的SnRK2.7蛋白（GenBank：ACG50011）、玉米的SnRK2.8蛋白（GenBank：ACG50012）等，分析克隆所得蘋果屬植物蛋白與以上已知植物蛋白的同源關(guān)系。結(jié)果表明，SnRK2.6和SnRK2.7與Zm SnRK2.6（ACG50010）、Zm SnRK2.7（ACG50011）聚類在同一分支上，Sn RK2.8與Gh SnRK2.6（AFH96416）、Np SnRK2.6（ACQ42253）、Zm SnRK2.8（ACG50012）聚類在同一分支上，且與Gh SnRK2.6（AFH96416）的親緣關(guān)系最為接近，從而推測(cè)這些蛋白具有類似功能。其余類似蛋白激酶的同源關(guān)系見圖6。進(jìn)化分析結(jié)果表明，3種SnRK2蛋白可能參與脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，響應(yīng)植物對(duì)干旱、高鹽及低溫脅等逆境的非生物脅迫。

2.5?干旱脅迫下蘋果屬SnRK2基因的表達(dá)

提取來(lái)自蘋果屬“SH6”葉片的總RNA，進(jìn)行熒光定量 PCR分析，分析干旱脅迫對(duì)這些基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明，在干旱條件下，“SH6”抗旱砧木中3種SnRK2基因的表達(dá)量普遍降低，其中SnRK2.7的表達(dá)量顯著下降，證明SnRK2在干旱脅迫信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用（圖7）。

3?討論

（1）植物是固著生物，不能隨著周圍環(huán)境的變化而遷移，容易受到干旱、洪澇、冷、鹽和病蟲害等各種環(huán)境脅迫的侵害;而基因表達(dá)調(diào)控和蛋白質(zhì)修飾是植物應(yīng)對(duì)這些脅迫的2個(gè)重要途徑[11]。蛋白激酶介導(dǎo)的磷酸化和去磷酸化過程在蛋白質(zhì)修飾中起著至關(guān)重要的作用[12]。在已報(bào)道的蛋白激酶基因中，蔗糖非發(fā)酵1（SNF1）相關(guān)蛋白激酶（SnRKs）是一類Ser/Thr蛋白激酶，通過磷酸化修飾靶蛋白來(lái)調(diào)控多種信號(hào)途徑的相互聯(lián)系，參與不同的生理過程[13-14]。蘋果作為多年生植物，其生長(zhǎng)發(fā)育和果實(shí)產(chǎn)量不斷受到各種環(huán)境脅迫的影響。蘋果SnRK2基因家族的鑒定為基因在脅迫反應(yīng)中的功能研究提供了基礎(chǔ)，蘋果中已經(jīng)鑒定出12個(gè)SnRK2蛋白序列，其中MpSnRK2.1/2.8/2.9/2.10可能被ABA強(qiáng)烈激活，參與ABA信號(hào)的感知[15]，因此，SnRK2在干旱脅迫和ABA信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要的作用。滲透脅迫會(huì)激活植物體內(nèi)的SnRK，迅速改變植物ABA激素應(yīng)答基因的表達(dá)和代謝[16]，以適應(yīng)不良環(huán)境。

（2）該研究結(jié)果表明，干旱處理中抗旱砧木“SH6”中SnRK2基因的表達(dá)量存在差異，從蘋果屬植物“SH6”葉片中提取的總cDNA中克隆到3種SnRK2基因SnRK2.6、SnRK2.7和SnRK2.8的CDS，其編碼區(qū)全長(zhǎng)分別為956、1 013和1 072 bp，分別編碼318、337和357個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。同源比對(duì)結(jié)果顯示，“SH6”中3種SnRK2基因的CDS序列同源性較高，均含有PKc_like超級(jí)家族和S_TKc結(jié)構(gòu)域;其蛋白質(zhì)3級(jí)結(jié)構(gòu)相似，且疏水性不明顯，但亞細(xì)胞定位不一致。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，“SH6”中的3種SnRK2蛋白與玉米、陸地棉和煙草等植物中SnRK蛋白的親緣關(guān)系較近，暗示它們?cè)谡{(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育方面具有相似的功能。除此之外，還發(fā)現(xiàn)“SH6”中分離得到的3種SnRK2在以下方面存在差異：由于其序列存在27.93%的差異堿基，造成了SnRK2.6、SnRK2.7和SnRK2.8的理論等電點(diǎn)不同，表觀分子量亦然;雖然它們的保守基序基本一致，但在保守結(jié)構(gòu)域上存在一些差異，這些差異可能是27.93%的堿基差異、基序差異，甚至是蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)上的差異造成，可能會(huì)引起不同種類SnRK2基因在植物器官和組織內(nèi)表達(dá)量的不同，由此造成它們?cè)诜巧锩{迫方面的應(yīng)激性差異。

（3）矮化中間砧品種“SH6”具有嫁接親和力好、無(wú)“大小腳”現(xiàn)象、抗性強(qiáng)、固地性好、壓條易繁殖等特點(diǎn)，且早果豐產(chǎn)，抗旱及抗黃化病能力強(qiáng)，品質(zhì)優(yōu)良，但耐鹽堿力較差。該研究克隆和分析了“SH6”中的SnRK2基因，并探索了脅迫條件對(duì)SnRK2基因表達(dá)的影響，有助于加深了解SnRK家族

在植物抗逆等相關(guān)過程中的機(jī)理，為提高植物抗逆性及蘋

果果實(shí)優(yōu)產(chǎn)豐產(chǎn)奠定了初步的理論基礎(chǔ)。

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