林卡帥?邱月?董蘭?周姍姍?黃俊?秦曙光?何鳳

【摘要】目的 探討長鏈非編碼 RNA（lncRNA）在糖尿病腎?。―N）發(fā)生發(fā)展中的作用。方法 收集臨床腎活組織檢查標(biāo)本，采用RNA-seq 測序技術(shù)檢測DN組與正常對照組（NC組）腎組織中差異表達(dá)的lncRNA及mRNA。通過 GO、KEGG數(shù)據(jù)庫分析差異表達(dá)mRNA的生物學(xué)功能，并通過共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析預(yù)測差異表達(dá)lncRNA的相互作用基因。采用實(shí)時熒光定量 PCR（qRT-PCR）檢測目標(biāo)lncRNA、mRNA 在DN腎組織中的相對表達(dá)水平。結(jié)果 RNA-seq 測序結(jié)果表明，與NC組相比，DN組共有353個差異表達(dá)的lncRNA，其中224個表達(dá)上調(diào)，129個表達(dá)下調(diào)。qRT-PCR 結(jié)果顯示，DN組中CRNDE、PVT1和 BLZF2P 相對表達(dá)水平較NC組升高（P均< 0.001），而WT1-AS、TARID 和 ST13P6相對表達(dá)水平較NC組降低（P均< 0.001）。共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析及雙變量相關(guān)分析顯示lncRNA CRNDE 與 NPHS1（編碼的 nephrin 是足細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性和發(fā)揮功能的決定性關(guān)鍵蛋白）呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論 lncRNA CRNDE 在DN腎組織中表達(dá)明顯升高，且與 NPHS1存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，lncRNA CRNDE 可能通過調(diào)控 NPHS1 的表達(dá)促進(jìn)DN足細(xì)胞損傷。

【關(guān)鍵詞】糖尿病腎病;長鏈非編碼核糖核酸;CRNDE;NPHS1;足細(xì)胞

Long non-coding RNA CRNDE promotes podocyte indury in diabetic nephropathy by regulating NPHS1 expression Lin Kashuai， Qiu Yue， Dong Lan， Zhou Shanshan， Huang Jun， Qin Shuguang， He

Feng. School of Medicine， South China University of Technology， Guangzhou 510006， China

Corresponding author， He Feng， E-mail： eyhefeng@ scut. edu. cn

【Abstract】Objective To investigate the role of long non-coding RNAs （lncRNAs） in the incidence and progression of diabetic nephropathy （DN）. Methods The differentially-expressed lncRNAs and mRNAs in the kidney biopsy specimens were detected by RNA-seq sequencing between the DN and normal control groups （NC）. The biological functions of differentially-expressed mRNAs were analyzed through the GO and KEGG databases， and the interaction among differentially-expressed lncRNAs and mRNAs was analyzed through co-expression network analysis. The relative expression levels of target lncRNAs and mRNAs in DN kidney tissues were detected by real-time fluorescent quantitative PCR （qRT-PCR）. Results RNA-seq sequencing results showed that a total of 353 differentially-expressed lncRNAs in the DN group compared with that in the NC group， in which 224 were up-regulated and 129 were down-regulated. qRT-PCR revealed that the relative expression levels of CRNDE， PVT1 and BLZF2P in the DN group were significantly higher （all P < 0.001）， whereas the relative expression levels of WT1-AS， TARID and ST13P6 were remarkably lower than those in the NC group （all P < 0.001）. Moreover， co-expression network analysis and bivariate correlation analysis demonstrated that lncRNA CRNDE was negatively correlated with NPHS1 （the encoded nephrin is the decisive key protein for the structural integrity and function of podocytes）. Conclusions The expression level of lncRNA CRNDE is significantly up-regulated in DN patients， which is negatively correlated with NPHS1， indicating that lncRNA CRNDE may promote the podocyte damage in DN by regulating the expression level of NPHS1.

【Key words】Diabetic nephropathy;Long non-coding RNA;CRNDE;NPHS1;Podocyte

糖尿病腎?。―N）是糖尿病全身性微血管病變常見的并發(fā)癥，是我國終末期腎?。‥SRD）的主要病因，并且成為目前慢性疾病防治的重要問題之一[1-2]。越來越多的研究顯示，在DN早期，當(dāng)系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞尚未改變時就已出現(xiàn)足細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為足細(xì)胞數(shù)量減少，胞體縮小，足突增寬融合、消失，進(jìn)而引起蛋白尿?qū)е履I功能惡化進(jìn)展[3-4]。因此，足細(xì)胞損傷是DN早期重要的病理基礎(chǔ)，然而其參與DN發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚未完全闡明。

隨著測序技術(shù)的發(fā)展及精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的提出，以 Illumina高通量測序?yàn)榇淼亩鷾y序技術(shù)成為當(dāng)下檢測已知、預(yù)測未知RNA的首選技術(shù)，為在分子水平尋找生物標(biāo)志物提供了極大的便利。長鏈非編碼 RNA（lncRNA）是一類數(shù)量龐大、轉(zhuǎn)錄本長度大于 200個核苷酸且不具有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA。近年多項(xiàng)研究顯示，lncRNA的異常表達(dá)與惡性腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)疾病及代謝性疾病等多種疾病相關(guān)[5-7]。同時也有研究提示lncRNA 廣泛參與DN發(fā)生發(fā)展的各個環(huán)節(jié)[6， 8-9]。然而，目前發(fā)現(xiàn)功能的lncRNA還是少數(shù)，lncRNA的具體作用方式仍未完全清楚。本研究通過對人臨床樣本腎組織進(jìn)行RNA-seq測序，檢測并分析DN組與正常對照組（NC組）差異表達(dá)的lncRNA及其特點(diǎn)，這將有助于深入探討lncRNA在DN中發(fā)揮的作用機(jī)制，為尋找DN防治的有效新靶點(diǎn)提供依據(jù)。

材料與方法

一、標(biāo)本來源

本研究收集了2018年10月至2019年12月在廣州市第一人民醫(yī)院住院并經(jīng)活組織檢查（活檢）證實(shí)為DN的患者腎組織樣本4例（DN組），以及來源于腫瘤相鄰的正常腎切除樣本腎組織4例（NC組）。DN診斷符合中國防治指南2019年版的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]。DN組標(biāo)本來源患者中，男2例、女2例，年齡（55.7±3.6）歲，BMI（24.2±2.2）kg/m2;NC組標(biāo)本來源患者中男2例、女2例，年齡（54.8±4.5）歲，BMI（24.2±2.2）kg/m2。本研究經(jīng)廣州市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得所有入組患者的知情同意。標(biāo)本采集后，立即使用RNA保護(hù)液浸泡于凍存管中，放入液氮罐中保存?zhèn)溆谩?/p>

二、主要儀器及試劑

包括Thermo Eppendorf常溫/低溫離心機(jī)，Thermo Nanodrop 2000分光光度計(jì)，Roche普通PCR儀，Roche實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）儀，

TRIzol RNA提取液及Takara含EB的RNA載樣緩沖液，OMEGA RNA保護(hù)液，諾唯贊高效模板DNA（cDNA）一鏈合成試劑盒，諾唯贊SYBR? Premix Ex TaqTM （GreenⅠ嵌合熒光法法），Sigma焦碳酸二乙酯（DEPC）。

三、方 法

1. 組織RNA的提取

使用TRIzol 提取液提取組織標(biāo)本RNA，按試劑盒說明步驟操作，提取RNA后使用Nanodrop 2000分光光度計(jì)測定RNA的濃度及鑒定純度。隨后，使用瓊脂凝膠電泳鑒定RNA完整度。

2. RNA-seq測序及篩選差異基因

分離提純RNA后，送上?？党缮锕こ逃邢薰拘蠷NA-seq測序，得到腎組織組間差異表達(dá)的lncRNA、mRNA及各自表達(dá)豐度值（FPKM）等信息。本研究中差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為：log2 倍數(shù)變化（FC）≥ 1 且P≤0.05。log2 FC ≥ 1 即為上調(diào)的差異基因，log2 FC ≤-1 為下調(diào)的差異表達(dá)基因。

3. 基因表達(dá)水平檢測

將RNA按照試劑盒說明書步驟合成cDNA， 然后進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系總體積20 μl，具體如下：SYBR? Green預(yù)混液10 μl、正向引物 0.2 μl、反向引物0.2 μl，無酶水 7.6 μl、cDNA 2 μl。反應(yīng)條件如下： 94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，58℃ 30 s 共40個循環(huán)，72 ℃ 20 s。溶解曲線分析：62 ～ 95 ℃。

每份樣本重復(fù)3次。2-ΔΔCt法計(jì)算熒光強(qiáng)度閾值（Ct值），以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算樣品基因相對表達(dá)量。

4. 生物信息學(xué)分析

選出DN和NC組織之間差異表達(dá)的lncRNA和mRNA，并使用R軟件（3.4.1版）“l(fā)imma”軟件包將其可視化。簡而言之，根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)Padjust（P < 0.05和FC > 2）處理數(shù)據(jù)以選擇差異表達(dá)基因（DEG）。此外，分別采用GO、KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能和信號通路富集分析。使用R軟件“ggplot2”“easygplot2”軟件包，通過dotplot和joyplot將KEGG結(jié)果中最豐富的信號通路（調(diào)整后的P < 0.01）可視化。Cytoscape（版本3.6.0）用于基于差異表達(dá)的lncRNA和mRNA進(jìn)行共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，DN組與NC組腎組織組間差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。差異表達(dá)的lncRNA與mRNA之間關(guān)系采用Spearman秩相關(guān)分析。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、lncRNA CRNDE在人DN腎組織中表達(dá)上調(diào)

DN組與NC組間鑒定出353條差異表達(dá)的lncRNA，與NC組相比，DN組中有224條表達(dá)上調(diào)，129條表達(dá)下調(diào)。其中以 |log2FC| ≥2且P≤ 0.01為篩選條件，選取了DN組中顯著差異表達(dá)的上調(diào)和下調(diào)各20條lncRNA，見圖1A。同時，圖1B的火山圖顯示了DN組與NC組間總的差異表達(dá)的lncRNA。進(jìn)一步，采用qRT-PCR對樣本進(jìn)行驗(yàn)證，與測序結(jié)果一致，PVT1（t = -12.518，P < 0.001）、CRNDE（t = -13.964，P < 0.001）和BLZF2P（t = -12.817，P < 0.001）的表達(dá)水平在DN組中相對NC組上升，而ST13P6（t = 11.409，P < 0.001）、TARID（t = 9.987，P < 0.001）和WT1-AS（t = 7.787，P < 0.001）在DN組中的表達(dá)水平相對NC組下降，見圖1C。

二、足細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能決定性基因NPHS1在DN腎組織中表達(dá)下調(diào)

生物信息學(xué)差異分析篩選出DN組和NC組之間的DEG，用熱圖的形式展示了2組差異表達(dá)的mRNA，見圖2A。利用R軟件對差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行KEGG 通路富集分析，DN組的NF-κB 信號通路、趨化因子通路、細(xì)胞因子受體通路異常激活，見圖2B。圖2C顯示了DN組中上調(diào)和下調(diào)各10個差異表達(dá)的mRNA， NPHS1在DN組中表達(dá)下調(diào)，圖2D GO富集分析功能表明NPHS1與腎單位發(fā)育及腎臟系統(tǒng)形成密切相關(guān)，提示 NPHS1的下調(diào)參與了DN的發(fā)病。

三、DN組織中l(wèi)ncRNA CRNDE 與NPHS1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)

利用R軟件和Cytoscape在DN腎組織差異表達(dá)的lncRNA和mRNA之間建立共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，DN組織中l(wèi)ncRNA CRNDE與NPHS1的表達(dá)相關(guān)，見圖3。同時，通過qRT-PCR分析DN臨床腎組織樣本，Spearman秩相關(guān)分析驗(yàn)證了lncRNA CRNDE與NPHS1之間負(fù)性相關(guān)的表達(dá)調(diào)控關(guān)系（rs = -0.798，P < 0.001）。結(jié)果提示lncRNA CRNDE 可能通過調(diào)控 NPHS1的表達(dá)促進(jìn)DN足細(xì)胞損傷，從而參與調(diào)控DN發(fā)生發(fā)展的過程。

討論

本研究通過RNA-seq測序挖掘DN中差異表達(dá)的lncRNA，DN組與NC組間共檢測到353條差異表達(dá)的lncRNA，其中224條在DN表達(dá)上調(diào)，129條表達(dá)下調(diào)。運(yùn)用生物信息學(xué)分析及qRT-PCR 檢測，結(jié)果顯示在DN組中l(wèi)ncRNA CRNDE表達(dá)升高，而其與參與調(diào)控足細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)鍵基因NPHS1有關(guān)。既往研究表明，核因子-κB （NF-κB）是DN的關(guān)鍵炎癥刺激通路，同時趨化因子和細(xì)胞因子也與炎癥狀態(tài)有關(guān)[11]。

NPHS1基因編碼的nephrin蛋白，Tossidou 等在2010年已經(jīng)證明其位于腎小球相鄰足細(xì)胞之間的裂隙隔膜上，是腎小球足細(xì)胞的標(biāo)志性分子之一。同年，Vitureira 等報道，該蛋白在控制細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、影響足細(xì)胞的形態(tài)和活性以及維持腎小球?yàn)V過功能的完整性等方面發(fā)揮著重要作用。適當(dāng)水平的nephrin表達(dá)對正常腎小球功能是必要的。早在2002年Cooper等已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在蛋白尿性腎病的動物模型中，nephrin的表達(dá)被證明是減少的，盡管還有其他蛋白質(zhì)參與足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，特別是裂孔的結(jié)構(gòu)，但nephrin似乎在阻止蛋白質(zhì)通過腎小球屏障方面起著關(guān)鍵作用，而DN與大量蛋白尿和裂孔密度降低有關(guān)[3， 12-14]。本研究通過RNA-seq篩選及qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果均表明DN腎組織中NPHS1表達(dá)下調(diào)，明確了DN腎臟存在足細(xì)胞損傷，揭示NPHS1的表達(dá)調(diào)控將有利于闡明足細(xì)胞損傷的機(jī)制。

lncRNA CRNDE與膿毒癥相關(guān)腎損傷，炎癥通路異常激活觸發(fā)的疾病，以及與癌癥進(jìn)展相關(guān)性，并在其中可能所起的作用已經(jīng)有了相關(guān)報道[15-17]。

在腎損傷模型中，通過敲低lncRNA CRNDE可以阻斷Toll樣受體3/NF-κB途徑的激活來降低脂多糖誘導(dǎo)的腎損傷[15]。在肺炎模型中，有研究表明CRNDE過表達(dá)加重人胚肺細(xì)胞（WI-38）的損傷，降低細(xì)胞活力，升高細(xì)胞凋亡和炎性細(xì)胞因子水平[16]。同時有研究表明，lncRNA CRNDE可能通過Toll樣受體途徑觸發(fā)炎癥反應(yīng)來調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17]。此前的諸多研究表明，炎癥狀態(tài)與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[18-19]。在結(jié)直腸癌中，lncRNA CRNDE通過miR-181a-5p介導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號通路傳導(dǎo)調(diào)控促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和化學(xué)抗性[20]。β-catenin是介導(dǎo)DN Wnt信號通路的關(guān)鍵因子，其異常可導(dǎo)致足細(xì)胞功能障礙、蛋白尿以及腎臟纖維化[21]。本研究顯示lncRNA CRNDE 與NPHS1存在負(fù)相關(guān)，基于nephrin對于維持足細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和發(fā)揮功能的重要性，我們推測在DN腎組織中長鏈非編碼RNA CRNDE通過調(diào)控NPHS1的表達(dá)，從而對足細(xì)胞造成損傷，進(jìn)而破壞腎小球?yàn)V過功能的完整性，參與調(diào)控了DN的發(fā)生發(fā)展。

本研究顯示，DN中l(wèi)ncRNA CRNDE的表達(dá)與NPHS1呈負(fù)相關(guān)，提示lncRNA CRNDE可能通過調(diào)控NPHS1影響足細(xì)胞關(guān)鍵蛋白nephrin的表達(dá)，從而破壞腎小球?yàn)V過屏障的完整性，參與了DN的發(fā)生發(fā)展。這進(jìn)一步豐富了DN的發(fā)病機(jī)制，為DN靶基因治療提供了新的靶點(diǎn)，為尋找DN診斷及預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物提供依據(jù)。而lncRNA CRNDE如何調(diào)控NPHS1的表達(dá)值得進(jìn)一步深入研究，這將為闡明DN足細(xì)胞損傷提供科學(xué)依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2021-03-24）

（本文編輯：林燕薇）