張 月,王耀一,武雪亮,張志生,楊修明,姜 洋,喬志飛,梁晚平,薛 軍

(河北北方學院附屬第一醫(yī)院乳腺外科,張家口 075000;*通訊作者,E-mail:xuejunhebei@163.com)

三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)發(fā)病年輕,就診時原發(fā)腫瘤大,組織學分級高,腋淋巴結陽性者較多,分期較晚,生物學上更具有侵襲性,由于TNBC缺乏雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長因子受體2(HER-2)的表達,傳統(tǒng)細胞毒性化療,仍然是治療三陰性乳腺癌的有效方法,可選擇藥物并不多,受到耐藥性的限制,治療方法有限,臨床預后差[1]。然而,目前尚無十分有效的靶向治療藥物,發(fā)掘新的治療靶點和開發(fā)新的藥物,改善三陰性乳腺癌的療效和預后,成為我們研究的重點。

ZM447439作為高選擇性Aurora A、B抑制劑,證實在急性骨髓淋巴細胞系可有效誘導凋亡[2],但關于ZM447439抑制乳腺癌細胞侵襲及轉移方面研究較少,本研究通過探討ZM447439對Aurora激酶高表達的三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-231凋亡和運動能力的影響及分子機制,從而為晚期乳腺癌的治療提供有效靶點、發(fā)掘有效抗癌藥物提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

MDA-MB-231細胞系由河北北方學院實驗室傳代保存。ZM447439由Selleck chemicals公司惠贈。RPMI-1640培養(yǎng)液購自美國Gibico公司;胎牛血清購自新西蘭Hyclone公司;趨化小室購自美國Neuro Probe公司;Fibronectin購自美國Sigma公司;BCA蛋白分析試劑盒購自美國Pierce公司;p-Aurora A、Aurora A、p-HistoneH3、HistoneH3、cdc25c、p-cdc25c、cdc2、p-cdc2、p-絲切蛋白(Cofilin-1)、Cofilin-1、Bcl-XL、Bcl-2、PARP、Caspase-3、β-actin一抗單克隆抗體均購自美國Cell Signaling公司。染料Hochest 333342、Yo-Pro-1購于美國Invitrogen公司;Annexin Ⅴ/碘化丙啶(propidium iodide,PI)試劑盒購自美國BD pharmingen公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測細胞增殖制率 取不同濃度(0,0.01,0.1,1,10 μmol/L)ZM447439分別處理MDA-MB-231細胞24,48 h后每孔加入MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清,加入二甲基亞砜震蕩充分溶解顯色,酶標儀波長570 nm處檢測各孔吸光度(A)值,計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=(對照孔A值-加藥孔A值)/對照孔A值×100%。

1.2.2 細胞周期和DNA倍體分析 將進行細胞周期檢測的MDA-MB-231細胞,分別用ZM447439濃度為0,1 μmol/L處理細胞48 h,收集細胞并調整細胞數(shù)至1×106/ml,用冷PBS洗滌細胞,離心,預冷的95%乙醇固定,再離心,棄去乙醇,加入PI后,在流式細胞儀上機分析,檢測每管樣品1×104個,并用Multicycle軟件進行DNA倍體及細胞周期的分析。

1.2.3 熒光染料顯色法檢測細胞多核現(xiàn)象 MDA-MB-231細胞以適當細胞濃度接種于6孔板中。將ZM447439以0,1,10 μmol/L預處理細胞24 h,PBS沖洗,1 μmol/L ZM447439處理MDA-MB-231細胞48 h加入Hoechst 33342(5 μg/ml)染色液,Hoechst 33342是DNA特異性染料,將細胞核染為藍色,室溫孵育30 min后,倒置熒光顯微鏡下觀察多核細胞。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 ZM447439(0,0.1,1,10 μmol/L)處理MDA-MB-231細胞,24 h后收集細胞,用0 ℃預冷的PBS洗滌2次,調整細胞密度,取105個細胞進行試驗,分別加Annexin Ⅴ 5 μl和PI(5 mg/L)5 μl,混勻,室溫避光孵育15 min后,加入500 μl結合緩沖液,4 ℃靜置30 min,在流式細胞儀上測定細胞凋亡率。

1.2.5 Western Blotting檢測凋亡相關蛋白(Bcl-2、Bax、PARP等)的表達 ZM447439(0,0.01,0.1,1,10 μmol/L)處理細胞后進行裂解、變性、進行蛋白定量后電泳,分離蛋白,轉膜。封閉后將膜轉入p-Aurora A、Aurora A、p-Histone H3、Histone H3、CyclinB1、cdc25c、p-cdc25c、cdc2、p-cdc2、p-cofilin-1、Cofilin-1、Bcl-XL、Bcl-2和PARP一抗稀釋液(1 ∶1 000)中4 ℃過夜,二抗室溫孵育1 h,TBST洗膜3次后ECL顯影,于暗室曝光。

1.2.6 劃痕試驗 將細胞接種于6孔板內培養(yǎng),待細胞長滿單層后用滅菌10 μl槍頭在細胞單層上垂直劃痕,用PBS洗兩次以洗去細胞碎片,加入ZM447439(0,0.01,0.1,1,10 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng),以0,3,6,12,24 h為時間梯度,在倒置顯微鏡下測量劃痕愈合程度,計算平均值。

1.2.7 趨化試驗 ZM447439(0,0.01,0.1,1,10 μmol/L)分別處理MDA-MB-231細胞24 h,調整細胞密度至1×105/ml,在Boyden趨化小室上室中加入,取0.001% Fibronectin包被后的聚碳酸酯膜置于趨化小室的上下室之間壓緊,在上室中加入上述細胞懸液250 μl,培養(yǎng)5 h后取出聚碳酸酯膜,將穿過膜的細胞固定染色后,在顯微鏡下(×40)隨機取3個視野,計數(shù)穿膜細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 ZM447439抑制細胞增殖

MTT法顯示不同濃度ZM447439(0.01,0.1,1,10 μmol/L)分別作用24,48 h時,在同一時間下隨著ZM447439藥物濃度的增加,細胞增殖抑制率逐漸增加;在同一濃度下隨著ZM447339藥物作用時間的延長,細胞增殖抑制率逐漸增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),ZM447439對MDA-MB-231細胞的增殖抑制作用具有劑量及時間依賴性,24 h的IC50值為(0.15±0.33)μmol/L,10 μmol/L ZM447439作用于MDA-MB-231細胞24,48 h增殖抑制率為(62.23±0.03)%和(84.17±0.01)%(見圖1)。

與0 μmol/L比較,*P<0.05圖1 ZM447439作用于MDA-MB-231細胞不同時間的抑制率Figure 1 Inhibition rate of MDA-MB-231 cell proliferation after treated with ZM447439 for different time by MTT

2.2 ZM447439誘導MDA-MB-231細胞多核的形態(tài)學變化

與0μmol/L相比,1 μmol/L ZM447439作用于MDA-MB-231細胞48 h可見細胞核分葉,出現(xiàn)多核現(xiàn)象(見圖2)。

圖2 ZM447439作用于MDA-MB-231細胞48 h可誘導多核細胞 (×100)Figure 2 ZM447439 induced polynuclear of MDA-MB-231 after treatment for 48 h

2.3 ZM447439對細胞周期和凋亡的影響

1 μmol/L ZM447439作用于MDA-MB-231細胞48 h出現(xiàn)了多倍體現(xiàn)象(見圖3),且0.1,1,10 μmol/L的ZM447439分別作用于MDA-MB-231細胞時,凋亡率分別為(17.4±2.2)%,(28.5±3.1)%,(51.8±5.4)%。與對照組[(0.6±0.2)%]相比,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖4),可見隨著ZM447439濃度的增加,細胞的凋亡率增加。Western blotting顯示,隨ZM447439濃度的增加,抗凋亡蛋白Bcl-XL、Bcl-2表達逐漸減少,而凋亡相關蛋白PARP剪切帶更加明顯(見圖5)。

1.G1峰;2.G2/M峰圖3 ZM447439作用48 h對MDA-MB-231細胞周期的影響Figure 3 Effects of ZM447439 on cell cycle of MDA-MB-231 at 48 h

圖4 ZM447439對MDA-MB-231細胞凋亡率的影響Figure 4 Effects of ZM447439 on apoptotic rate of MDA-MB-231

與0 μmol/L比較,*P<0.05圖5 ZM447439對MDA-MB-231細胞凋亡相關蛋白表達的影響Figure 5 Effect of ZM447439 on apoptotic proteins in MDA-MB-231 by Western blot

2.4 ZM447439對細胞劃痕愈合能力的影響

0 μmol/L ZM447439作用24 h劃痕已大部分愈合,而10 μmol/L ZM447439作用后劃痕愈合速度明顯慢于0 μmol/L ZM447439(見圖6)。同一時間不同濃度ZM447439(0.01,0.1,1,10 μmol/L)分別與0 μmol/L相比,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖6),不同時間、不同濃度對細胞劃痕愈合能力的影響不同,同一時間隨著藥物濃度增加遷移距離減慢,同一濃度隨著時間增加遷移距離減慢。

圖6 ZM447439對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響Figure 6 Effects of ZM447439 on migration of MDA-MB-231

2.5 ZM447439對細胞趨化能力的影響

0,0.01,0.1,1,10 μmol/L ZM447439作用后穿膜細胞數(shù)分別為每個高倍鏡視野下129.7±2.1,103.3±2.5,96.0±3.6,79.3±2.3,68.3±2.8,0.01,0.1,1,10 μmol/L ZM447439組穿膜細胞數(shù)分別與0 μmol/L組相比,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖7)。隨著ZM447439濃度的增加,穿膜細胞數(shù)目減少。

圖7 ZM447439對MDA-MB-231細胞趨化能力的影響Figure 7 Effects of ZM447439 on chemotaxis of MDA-MB-231

2.6 ZM447439對細胞Aurora A、Histone H3、cdc25c、cdc2、Cofilin-1磷酸化水平及CyclinB1的影響

隨著ZM447439濃度的增加,Aurora A、HistoneH3、Cofilin-1總蛋白表達沒有明顯變化,而相應磷酸化蛋白逐漸減少,cdc25c、cdc2總蛋白表達沒有明顯變化,而相應磷酸化蛋白逐漸增加(見圖8),提示ZM447439可以有效抑制Aurora激酶和Cofilin-1磷酸化水平及CyclinB1的表達。

圖8 Western blot對MDA-MB-231細胞周期相關蛋白表達的影響Figure 8 Effects of ZM447439 on expression of cell cyclin proteins in MDA-MB-231 by Western blot

3 討論

TNBC作為一種獨特的乳腺癌亞型,其臨床、病理以及分子生物學特征具有高度異質性,有著某些獨特的生物學行為,其中95%TNBC為浸潤性導管癌,只有1%-2%TNBC為浸潤性小葉癌,在診斷TNBC的前3年內早期復發(fā)風險高,遠處轉移常見,肺、腦轉移率高,病情進展快,對于gBRCA突變的TNBC,PARP抑制劑是可選擇的唯一靶向藥物,只有10%的TNBC存在gBRCA突變,TNBC腫瘤異質性很高,PARP抑制劑并不適合所有TNBC患者,尋找新的靶點對于TNBC有著重要意義,Aurora激酶為TNBC的治療提供新的思路。

Aurora激酶家族屬于絲蘇氨酸激酶,在有絲分裂染色體線性結構形成,胞質分離中有重要作用,包括Aurora A、Aurora B、Aurora C三種,AuroraA位于近中心體區(qū)域,負責收集在有絲分裂中形成線粒體的重要物質,調節(jié)G2期向M期過渡,有研究證實,到目前為止Aurora激酶家族中只有Aurora A是致癌基因[3-5]。Aurora B作為染色體信使蛋白在有絲分裂前中期位于中心體,在后期及末期位于微管中區(qū),Aurora B在染色體線性結構形成,著絲點微管雙定位,紡錘體檢查點激活和細胞分裂中發(fā)揮作用,并且與組蛋白H3的磷酸化相關[6]。Aurora C位于染色體信使復合物中,在細胞周期中維持紡錘絲的整體性。

小分子Aurora激酶抑制劑ZM447439抑制TNBC細胞運動,誘導凋亡從以下幾方面體現(xiàn):①ZM447439抑制TNBC細胞增殖:TNBC細胞周期的進程啟動是由細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)家族的成員與細胞周期蛋白結合共同作用的,cyclinB1/CDK1在成熟促進因子(MPF)中心有催化活性,在G2期不被激活,當核胞膜破裂前被激活,有絲分裂前期激發(fā)一系列反應[7]。磷酸化Aurora激酶減少可促進cdc25c轉化為磷酸化cdc25c,cdc25c磷酸化使CDK1的Thr14位點(即cdc2)磷酸化從而抑制cyclinB1/CDK1活性,ZM447439抑制Aurora激酶向磷酸化Aurora激酶轉化,使磷酸化cdc25c和磷酸化cdc2的表達增加,從而抑制cyclinB1的表達[8],阻止G2期向M期過渡,抑制細胞增殖,流式細胞術及Western blot證實了這一點。②ZM447439抑制TNBC細胞侵襲及轉移:TNBC細胞高侵襲性相關基因為Cofilin-1,Cofilin-1蛋白是肌動蛋白聚合和解聚的重要影響因子,促進形成細胞膜偽足,決定了細胞遷移的方向,細胞發(fā)生侵襲。Cofilin-1和p-Cofilin-1激活/失活調控癌細胞運動和轉移[9,10]。Aurora A增加有活性的Cofilin-1在乳腺癌中的表達,促進細胞骨架重組,降低細胞間的黏附性,促進細胞運動,從而促進乳腺癌細胞遷移和淋巴結轉移,Aurora激酶抑制劑可抑制乳腺癌細胞AuroraA的表達,下調p-Cofilin-1的表達,抑制乳腺癌細胞侵襲和轉移[11]。③ZM447439誘導TNBC細胞凋亡:ZM447439作為小分子Aurora激酶抑制劑可抑制Histone H3的磷酸化,使細胞核分裂失敗,乳腺癌細胞出現(xiàn)多核現(xiàn)象,胞質分離失敗,形成多倍體細胞和很少部分二倍體細胞,最終為非整倍體,抑制G2/M過渡,誘導凋亡[12],使促凋亡蛋白表達增加,抑制凋亡蛋白表達減少,同時抑制磷酸化Aurora A的表達,可引起G2/M期阻滯,抑制p-Cofilin-1的活性,從而抑制TNBC細胞的侵襲及轉移[13,14],本研究細胞劃痕試驗和趨化試驗也證實了這一點。本研究中24 h的IC50值為(0.15±0.33)μmol/L,10 μmol/L ZM447439作用于MDA-MB-231細胞24,48 h增殖抑制率為(62.23±0.03)%和(84.17±0.01)%,隨著ZM447439藥物濃度的增加,細胞凋亡明顯增加,在0.1,1,10 μmol/L凋亡率分別為(17.4±2.2)%,(28.5±3.1)%和(51.8±5.4)%,ZM447439可以增加MDA-MB-231細胞p-cdc25c、p-cdc2的表達,抑制CyclinB1,p-Cofilin-1表達,從而抑制遷移及趨化的能力,從分子機制上闡釋了ZM447439具有抑制腫瘤侵襲和轉移的作用Bcl-2表達逐漸減少,Bax,PARP剪切增加,抑制增殖,促進凋亡。

TNBC作為一個排他性診斷,事實上是一組異質性很大的疾病,依靠現(xiàn)有的臨床和病理指標難以對患者進行個體化治療和預后分析,TNBC治療需要分而治之,從而達到改善患者治療策略及預后目的,尋找潛在治療靶點至關重要,ZM447439抑制MDA-MB-231細胞系增殖、侵襲和轉移的研究,為Aurora激酶可作為治療TNBC新的靶點和ZM447439作為治療TNBC新的藥物提供了理論依據(jù)。