王曉倩,李丹丹,王 丹,王孟影,賀龍梅,3,王曉琴,馬運峰,4*

(1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科,西安 710061;2西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系;3陜西省中醫(yī)醫(yī)院檢驗科;4西安交通大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院感染免疫研究所;*通訊作者,E-mail:mayunfeng@xjtu.edu.cn)

乳腺癌是最常見的癌癥之一,也是全世界范圍內(nèi)女性癌癥相關(guān)死亡的首要原因[1]。雖然傳統(tǒng)的治療方法(手術(shù)治療、化療、放療等)有了很大的改進,但是幾乎所有轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者都會死亡,特別是三陰性乳腺癌,靶向治療效果微乎其微,因此尋找一種新的治療方法至關(guān)重要。普遍認為IL-10是一種免疫抑制因子,能夠下調(diào)主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類抗原(MHCⅡ)、CD80/CD86等表達以及抑制干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-2(IL-2)等細胞因子的分泌,從而抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答。但也有越來越多的證據(jù)證明,大劑量IL-10能夠促進抗腫瘤免疫,在黑色素瘤[2]、結(jié)腸癌[3]中已經(jīng)得到證實,但是在乳腺癌中的相關(guān)作用并不清楚。因此,本文從細胞水平以及動物水平研究過表達mIL-10對小鼠乳腺癌4T1細胞以及荷瘤生長的影響,并探討其作用機制,為臨床乳腺癌治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞系

SPF級BALB/c 6-8周雌性小鼠購買于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實驗中心,并且在該動物實驗中心SPF級實驗室飼養(yǎng)。小鼠乳腺癌細胞系4T1來自美國組織培養(yǎng)庫(American Tissue Culture Collection, ATCC),293T為本實驗室保存。

1.2 試劑

表達載體pLenti-CMV-GFP-puro、pLenti-CMV-mIL-10-GFP-puro購自質(zhì)粒與蛋白共享庫,包裝載體ΔR9、pVSVG為本實驗室保存,RPMI-1640(美國Hyclone公司),磷酸鹽緩沖液(美國Hyclone公司),胰蛋白酶(美國Hyclone公司),青霉素鏈霉素溶液(美國Hyclone公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),Pacific Blue anti-mouse CD45、PerCP-Cy5.5 anti-mouse CD3、PE-CY7 Rat anti-mouse CD4、BV510 Rat anti-mouse CD8、PE anti-mouse IFN-γ、APC anti-mouse MHCⅡ、PE anti-mouse PDL1、PE anti-mouse CD86、 APC anti-mouse IL-10(美國BioLegend公司),小鼠外周血淋巴細胞分離液試劑盒(北京索萊寶科技有限公司),膠原酶、透明質(zhì)酸酶、DNA酶(美國sigama公司),Cell Activation Cocktail(with Brefeldin A)(美國Biolegend 公司),Mouse IL-10 ELISA試劑盒(達科為生物技術(shù)有限公司)。

1.3 儀器

流式細胞儀(美國BeckmanCoulter公司)、超微量分光光度計(美國Thermo公司)、低溫離心機(美國Thermo公司)、DMILLED倒置顯微鏡 (德國Leica公司)、HERACELL150iC02細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)、SC-3610低速離心機(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)。

1.4 慢病毒包裝以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的建立

慢病毒包裝前1 d,將對數(shù)生長期的293T消化重鋪于60 mm細胞培養(yǎng)皿中,37 ℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜,第2天細胞密度達到70%-80%時,進行慢病毒包裝。重組質(zhì)粒pLenti-CMV-GFP-puro或者pLenti-CMV-mIL-10-GFP-puro各2.5 μg、慢病毒包裝質(zhì)粒ΔR9 2.25 μg、pVSVG 0.25 μg、500 μl不完全DMEM、5 μl Fugene混勻,室溫靜置30 min,隨后均勻的加入293T細胞培養(yǎng)液中,37 ℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。72 h后,收集病毒上清液,0.45 μm濾膜過濾,-80 ℃保存。

狀態(tài)良好的4T1細胞消化并接種于六孔板中,待細胞密度達60%左右即可進行慢病毒感染。丟棄原先的細胞培養(yǎng)上清液,加入5 ml病毒上清液和5 μl polybrene混勻,37 ℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h,棄去病毒液,加入新鮮的完全1640培養(yǎng)基,48 h后,添加嘌呤霉素(2 μg/ml)進行篩選。

1.5 流式細胞儀檢測感染效率

將4T1以及嘌呤霉素篩選后的4T1/GFP(對照組)、4T1/mIL-10(實驗組)擴大培養(yǎng)后,取100 μl細胞懸液過濾,流式細胞儀檢測感染效率。

1.6 ELISA以及FCM檢測mIL-10的表達水平

4T1、4T1/GFP、4T1/mIL-10細胞接種于六孔板中,48 h后收集細胞培養(yǎng)上清,2 000 r/min離心20 min,按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

細胞4T1、4T1/GFP、4T1/mIL-10經(jīng)Cell Activation Cocktail(with Brefeldin A)(1 ∶1 000)刺激4 h后,胰蛋白酶消化收集細胞,PBS清洗2遍,棄上清,500 μl fix buffer重懸,室溫避光20 min,加1 ml破膜劑,1 800 r/min離心5 min,棄上清,重復(fù)一遍,然后每管加100 μl破膜劑,加APC anti-mouse IL-10抗體1 μl,室溫避光20 min,每管加1 ml破膜劑,離心1 800 r/min,5 min,棄上清,加150 μl PBS,過濾細胞,流式細胞儀檢測。

1.7 細胞增殖能力檢測

將對數(shù)生長期的4TI/GFP、4TI/mIL-10細胞消化,以5×104個/孔種植于12孔板中,37 ℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),每隔1 d收獲細胞,臺盼藍染色,區(qū)分死活細胞,計算活細胞的數(shù)量,共計3次。

1.8 流式細胞術(shù)檢測細胞表面分子PDL1、MHCⅡ、CD86的表達水平

收集對數(shù)生長期的4T1、4TI/GFP、4TI/mIL-10細胞,PBS清洗兩遍,100 μl PBS重懸,PDL1、MHCⅡ、CD86抗體各加1 μl,冰上避光孵育20 min,1 ml PBS 1 500 r/min離心5 min,棄上清,重復(fù)一遍,300 μl PBS重懸,200目濾網(wǎng)過濾,流式細胞儀檢測。

1.9 皮下4T1乳腺癌轉(zhuǎn)移模型的建立

生長狀態(tài)良好的4TI/GFP、4TI/mIL-10細胞消化離心,重懸于PBS中,調(diào)整細胞密度為1×107/ml,每只小鼠皮下注射100 μl,觀察成瘤情況。每3 d用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小,以公式(長×寬×寬/2)計算腫瘤體積,繪制生長曲線。

1.10 FCM檢測腫瘤組織中免疫細胞的變化

荷瘤小鼠15 d后,將荷瘤小鼠安樂死,分離腫瘤組織,拍照。將瘤塊置于1640培養(yǎng)液中,手術(shù)剪將組織剪碎,使組織碎片小于5 mm。隨后,將剪碎的組織塊及液體轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中,加入膠原酶、透明質(zhì)酸酶、DNA 酶,使其終濃度分別為2 mg/ml,2 mg/ml,25 μg/ml,37 ℃消化45 min,研磨,70 μm濾網(wǎng)過濾,除去組織殘渣。PBS洗滌細胞,用小鼠淋巴細胞分離液富集淋巴細胞,PBS洗滌細胞兩遍,重懸。一部分流式細胞儀檢測腫瘤組織中CD4+T、CD8+T細胞的數(shù)量變化,另一部分細胞刺激劑刺激4 h,收獲細胞,然后用流式細胞儀檢測腫瘤組織中CD4+T、CD8+T細胞分泌IFN-γ的變化。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建過表達mIL-10的4T1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,對照組(4T1/GFP)和實驗組 (4T1/mIL-10)感染效率都達到93%以上(見圖1)。ELISA與FCM結(jié)果顯示,實驗組mIL-10的表達水平顯著高于對照組(P<0.05,見圖1)。結(jié)果表明,成功構(gòu)建過表達mIL-10的4T1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。

2.2 過表達mIL-10對4T1細胞增殖能力的影響

細胞計數(shù)顯示,4T1/mIL-10組與4T1/GFP組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見圖2)。結(jié)果表明,過表達mIL-10對4T1細胞的增殖能力無明顯影響。

圖1 過表達mIL-10的4T1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的構(gòu)建與鑒定Figure 1 Construction and identification of 4T1 stably transfected cell line overexpressing mIL-10

圖2 細胞計數(shù)檢測mIL-10過表達對4T1細胞增殖的影響Figure 2 Effect of IL-10 overexpression on the proliferation of 4T1 cells

2.3 過表達mIL-10對4T1細胞表面分子的影響

流式細胞儀檢測細胞表面CD86、MHCⅡ、PDL1的表達,發(fā)現(xiàn)4T1/mIL-10組與4T1/GFP組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見圖3)。結(jié)果表明,過表達mIL-10對4T1細胞表面CD86、MHCⅡ、PDL1的表達無影響。

圖3 過表達mIL-10后4T1細胞表面分子的變化Figure 3 Changes of surface molecules in 4T1 cells after overexpression of mIL-10

2.4 mIL-10治療后小鼠皮下4T1乳腺癌轉(zhuǎn)移模型中免疫細胞的變化

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示,與未治療組(4T1/GFP)相比,mIL-10治療組(4T1/mIL-10組)CD8+T/CD4+T比例明顯增加(P<0.05,見圖4)。腫瘤組織中,mIL-10能夠促進CD8+T細胞分泌IFN-γ(P<0.05),但對CD4+T細胞無明顯影響(P>0.05,見圖4)。結(jié)果表明,mIL-10能夠增強荷瘤小鼠的抗腫瘤免疫應(yīng)答。

與4T1/GFP組比較,*P<0.05圖4 4TI/mIL-10小鼠乳腺癌腫瘤組織中免疫細胞的變化Figure 4 Changes of immune cells in breast cancer tissues of 4T1/mIL-10 mice

2.5 mIL-10治療后荷瘤小鼠腫瘤大小變化

與未治療組(4T1/GFP)相比,mIL-10治療組(4T1/mIL-10)腫瘤大小明顯減小(P<0.05,見圖5)。結(jié)果表明mIL-10能夠顯著抑制腫瘤的生長。

圖5 荷瘤小鼠腫瘤大小變化Figure 5 Changes of tumor size in tumor bearing mice

3 討論

免疫治療已成為繼手術(shù)治療、化療和放射治療之后的第四大癌癥治療方法[4]。免疫檢查點阻斷劑(PD-1/PD-L1抑制劑、CTLA4抑制劑等)在不同腫瘤類型中的臨床應(yīng)用說明免疫治療的獨特之處。免疫刺激因子,比如IL-2能夠有效地激活免疫細胞,并獲得美國食品和藥物管理局(FDA)的批準(zhǔn)用于臨床[5]。如今,免疫治療已經(jīng)成為乳腺癌的一種新的治療方式[6]。作為一種異質(zhì)性疾病,乳腺癌具有3種不同的臨床亞型,分別為:Luminal、表皮生長因子受體-2+(HER-2+)以及三陰性乳腺癌。對于Luminal、HER-2而言,雌激素、孕激素以及赫賽汀(Herceptin)等免疫療法具有良好的反應(yīng)[7],而三陰性乳腺癌迄今為止沒有好的治療方法。

IL-10可以由多種細胞分泌,包括單核/巨噬細胞、B細胞、樹突狀細胞(DC)、CD4+以及CD8+T細胞等[8]。作為一種關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)因子,IL-10的缺乏與自身免疫性和炎癥性疾病有關(guān)。有文獻報道,在IL-10或者IL-10R缺乏的動物模型中,小鼠會自發(fā)地形成炎癥性腸病(IBD),IL-10治療后癥狀明顯改善[9]。一直以來,IL-10被認為可以抑制單核細胞與樹突狀細胞表面CD80/CD86、MHCⅡ分子的表達,從而促進腫瘤逃逸[10]。在正常生理條件下,PDL1/PD1信號通路起著負性調(diào)節(jié)的作用,防止免疫系統(tǒng)過度活化,維持機體免疫穩(wěn)態(tài)。在癌癥組織中,腫瘤細胞受到一些炎癥因子(如IFN-γ)的刺激,表面PDL1的表達上調(diào),與T細胞表面配體PD1結(jié)合后,引起T細胞的失能,這也是腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視的重要手段之一[11]。本研究通過慢病毒感染細胞,構(gòu)建過表達mIL-10的小鼠乳腺癌4T1細胞系,發(fā)現(xiàn)4T1細胞系表面CD86、MHCⅡ分子并沒有下降,而且PDL1的表達也沒變化,這極有可能與細胞類型有直接的關(guān)系。

免疫系統(tǒng)在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和控制中起著重要的作用[12]。其中,CD8+T細胞在抗腫瘤免疫應(yīng)答中起著重要的作用。活化的CD8+T細胞不僅能夠直接分泌穿孔素、顆粒酶直接殺傷腫瘤細胞,而且能夠分泌促炎因子IFN-γ來增強免疫應(yīng)答[13]。因此,一些腫瘤可以通過降低腫瘤特異性CD8+T的活性來介導(dǎo)免疫逃逸。在大多數(shù)抗腫瘤的免疫研究中,認為IL-10是引起免疫抑制腫瘤微環(huán)境的主要原因[14]。然而,與以往觀點不同,越來越多的證據(jù)證明IL-10能夠促進抗腫瘤免疫。Mumm等[15]發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性地注射聚乙二醇化的IL-10(PEG-IL-10)能夠促進腫瘤組織中CD8+T細胞的浸潤以及活化,從而抑制腫瘤的生長。Huang等[2]發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤小鼠模型中,mIL-10能夠抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在本研究中,過表達mIL-10對4T1細胞本身的增殖并沒有影響,這說明mIL-10在體內(nèi)抑制腫瘤的生長并不是通過影響腫瘤細胞本身引起的,這與Adris等[3]的研究一致。體內(nèi)實驗中,我們發(fā)現(xiàn)mIL-10治療組CD8+T/CD4+T比例明顯增加,而且CD8+T細胞活性增強,分泌更多的IFN-γ,但對CD4+T細胞無明顯影響。說明mIL-10并沒有改變4T1細胞本身的免疫原性,而是作用于宿主的免疫系統(tǒng),促進腫瘤組織中淋巴細胞的浸潤,從而延緩腫瘤的生長。

綜上所述,過表達mIL-10能夠促進抗腫瘤免疫應(yīng)答,從而抑制腫瘤的生長,為乳腺癌的治療方法提供新的思路與理論基礎(chǔ)。