陳健佳,張小梅,馬文斌,黃玉梅,趙 強(qiáng)

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬順德醫(yī)院心內(nèi)科,佛山 528315;*通訊作者,E-mail:326400975@qq.com)

心肌炎是一種會導(dǎo)致心臟功能障礙的心肌炎癥性疾病,病因包括免疫損傷、感染等,可顯著影響心臟的收縮和舒張功能,導(dǎo)致心律失常[1]。心肌炎的診斷主要依賴于免疫學(xué)、免疫組織化學(xué)及組織病理學(xué)[2]。心肌炎的具體發(fā)病機(jī)制目前并不明確,探究心肌炎的分子靶向治療具有重要意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類超過200個核苷酸組成的內(nèi)源性小分子RNA,屬于單鏈非編碼RNA[3]。lncRNA參與調(diào)控血管生成、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等各種細(xì)胞功能[4,5]。lncRNA廣泛參與各種心臟疾病的發(fā)生、發(fā)展過程[6]。研究表明,OIP5-AS1是一種lncRNA,其可通過抑制線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,降低急性心肌梗死后的心肌缺血再灌注損傷[7]。OIP5-AS1對細(xì)菌性心肌炎時心肌細(xì)胞損傷的研究尚未見報道。本研究旨在觀察OIP5-AS1對脂多糖誘導(dǎo)細(xì)菌性心肌炎時對大鼠原代心肌細(xì)胞的作用及可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞與試劑

用于分離原代心肌細(xì)胞的3 d新生SD大鼠購于武漢萬千佳興生物科技有限公司。載有OIP5-AS1序列的GFP慢病毒、空載GFP慢病毒、miR-NC、miR-181d-5p、OIP5-AS1野生型及突變型熒光報告載體購于廣州銳博生物技術(shù)有限公司。工具293細(xì)胞、ELISA試劑盒和CCK-8試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司。Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于美國BD公司。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于上海翊圣生物科技有限公司。轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000購于美國Invitrogen公司。膠原酶Ⅰ購于美國Sigma公司。實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒購于日本Takara公司。一抗和二抗購于美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 細(xì)胞分離、培養(yǎng)和分組

采用膠原酶Ⅰ將3 d新生SD大鼠的心臟組織解離為單細(xì)胞懸液,加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。將大鼠原代心肌細(xì)胞分為兩組:分別感染空載GFP慢病毒和載有OIP5-AS1序列的GFP慢病毒,感染復(fù)數(shù)(MOI)均為20,命名為對照組和實驗組。12 h后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。每組細(xì)胞分別滴加100 μl濃度為10 μmol/L脂多糖,24 h進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3 qRT-PCR檢測OIP5-AS1和miR-181d-5p的表達(dá)

TRIzol法提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行qRT-PCR檢測。反應(yīng)參數(shù):96 ℃預(yù)變惈3 min,96 ℃變性20 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,35個循環(huán)。OIP5-AS1的表達(dá)以β-actin為內(nèi)參,miR-181d-5p的表達(dá)以U6為內(nèi)參。引物序列如下:miR-181d-5p正向引物為AACAUUCAUUGUUGUC,反向引物為CGACGTGTAGTGTTTCCTA;U6正向引物位CTCGCTTCGGCAGCACA,反向引物為ACGCTTCACGAATTTGCGT。β-actin正向引物為TGTCACCAACTGGGACGATA,反向引物位GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA;OIP5-AS1正向引物為GTGTTGTGGAGATTGAGGCAGGAG,反向引物為GGCAAGGTGAAGGACAGACAGC。以2-ΔΔCt法計算OIP5-AS1和miR-181d-5p的相對表達(dá)。

1.4 ELISA法檢測腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素1β(IL-1β)含量

大鼠原代心肌細(xì)胞經(jīng)脂多糖處理24 h后,收集各組細(xì)胞的上清,根據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作,在酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測每孔吸光度(A)值,比較每組細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-1β的含量。

1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞活力

將經(jīng)脂多糖處理后的大鼠原代心肌細(xì)胞以每孔1×103個細(xì)胞接種于96孔板,設(shè)置4個復(fù)孔。24 h后,每孔加入20 μl CCK-8試劑,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,在酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測每孔吸光度(A)值,比較各孔的細(xì)胞活力。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

胰酶消化經(jīng)脂多糖處理后的大鼠原代心肌細(xì)胞,采用預(yù)冷的PBS溶液洗2次,采用緩沖液重懸,分別取100 μl細(xì)胞懸液加入流式管,分別加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC試劑和5 μl PI試劑,混勻后避光孵育25 min。加入100 μl緩沖液,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.7 生物信息學(xué)方法預(yù)測和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞COIP5-AS1的靶基因

采用生物信息學(xué)軟件Starbase預(yù)測OIP5-AS1的潛在靶向基因。采用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑，將OIP5-AS1野生型和突變型熒光報告載體分別和miR-NC或miR-181d-5p共轉(zhuǎn)染工具293細(xì)胞,24 h后根據(jù)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作,檢測每組細(xì)胞的相對熒光素酶活性。

1.8 Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達(dá)

對照組和實驗組細(xì)胞分別滴加100 μl濃度為10 μmol/L脂多糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷,24 h后采用預(yù)冷的PBS溶液洗2次,采用細(xì)胞裂解液提取總蛋白。蛋白變性后,采用十二烷基聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜,采用5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉,在4 ℃冰箱內(nèi)采用一抗Bcl-2(稀釋度1 ∶2 000)、Bax(稀釋度1 ∶1 000)、Caspase-3(稀釋度1 ∶1 000)孵育過夜,在室溫下采用二抗孵育2 h。均勻滴加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑,在凝膠成像系統(tǒng)中曝光、拍照。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞中OIP5-AS1的相對表達(dá)

對照組和實驗組細(xì)胞均顯著表達(dá)綠色熒光蛋白(見圖1),提示細(xì)胞感染成功。對照組和實驗組細(xì)胞中OIP5-AS1相對表達(dá)分別為1.01±0.07和9.22±1.06,實驗組OIP5-AS1相對表達(dá)明顯高于對照組(P<0.01,見圖2)。

圖1 對照組和實驗組細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)Figure 1 The expression of green fluorescent protein in control group and experimental group

與對照組比較,**P<0.01圖2 對照組和實驗組細(xì)胞中OIP5-AS1的相對表達(dá)Figure 2 The relative expression of OIP5-AS1 in control group and experimental group

2.2 高表達(dá)OIP5-AS1對TNF-α和IL-1β含量的影響

ELISA法結(jié)果顯示,脂多糖處理后對照組和實驗組培養(yǎng)基中TNF-α含量分別為(39.45±2.15)pg/ml和(30.26±1.85)pg/ml,兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);對照組和實驗組培養(yǎng)基中IL-1β含量分別為(22.49±1.50)pg/ml和(12.34±1.77)pg/ml,兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與對照組相比,實驗組培養(yǎng)基中TNF-α和IL-1β含量均明顯降低。

2.3 高表達(dá)OIP5-AS1對細(xì)胞活力的影響

CCK-8法結(jié)果顯示,脂多糖處理后的對照組和實驗組細(xì)胞活力分別為1.00±0.02和5.89±0.61,與對照組相比,實驗組細(xì)胞的活力明顯較高(P<0.01)。

2.4 高表達(dá)OIP5-AS1對細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞術(shù)顯示,脂多糖處理24 h后,實驗組和對照組細(xì)胞凋亡率分別為(22.70±1.88)%和(48.64±2.37)%;與對照組比較,實驗組高表達(dá)OIP5-AS1明顯抑制細(xì)胞的凋亡,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,見圖3)。

與對照組比較,**P<0.01圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測OIP5-AS1對細(xì)胞凋亡率的影響Figure 3 The effect of OIP5-AS1 on cell apoptosis rate was detected by flow cytometry

2.5 生物信息學(xué)方法預(yù)測OIP5-AS1的靶基因

采用生物信息學(xué)軟件Starbase預(yù)測OIP5-AS1可靶向結(jié)合miR-181d-5p(見圖4)。

圖4 生物信息學(xué)方法預(yù)測OIP5-AS1的靶基因Figure 4 Bioinformatics methods predicted the target gene of OIP5-AS1

2.6 OIP5-AS1與miR-181d-5p的靶向關(guān)系

雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，野生型miR-NC組、野生型miR-181d-5p組、突變型miR-NC組和突變型miR-181d-5p組的相對熒光素酶活性分別為1.02±0.08、0.30±0.04、1.08±0.15和1.01±0.06，野生型miR-181d-5p組較野生型miR-NC組明顯降低(P<0.01，見圖5)，證實OIP5-AS1與miR-181d-5p之間可靶向結(jié)合。

與野生型miR-NC組比較,**P<0.01圖5 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞COIP5-AS1與miR-181d-5p的靶向關(guān)系Figure 5 The dual luciferase reporter gene experiment verified the targeting relationship between OIP5-AS1 and miR-181d-5p

2.7 高表達(dá)OIP5-AS1對細(xì)胞中miR-181d-5p表達(dá)的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示,實驗組和對照組細(xì)胞miR-181d-5p的表達(dá)分別為0.19±0.06和1.01±0.06,高表達(dá)OIP5-AS1可抑制miR-181d-5p的表達(dá)(P<0.01)。

2.8 高表達(dá)OIP5-AS1對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,脂多糖處理的高表達(dá)OIP5-AS1的細(xì)胞中,抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加,促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達(dá)下降(見圖6)。

圖6 Western blot法檢測高表達(dá)OIP5-AS1后凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)Figure 6 Expression of apoptosis-related proteins after OIP5-AS1 overexpression by Western blot

3 討論

近年的研究表明,lncRNA在各種心血管事件的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要調(diào)控作用[8,9]。心肌炎導(dǎo)致炎性滲出,心肌細(xì)胞耗氧量增加,心肌細(xì)胞更易凋亡,導(dǎo)致惡性臨床事件[10]。lncRNA介導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷被廣泛的研究。Zhang等[11]研究發(fā)現(xiàn),lncRNA ROR通過調(diào)節(jié)C-Myc蛋白的表達(dá),促進(jìn)病毒性心肌炎大鼠心肌的纖維化。Cao等[12]研究發(fā)現(xiàn),在柯薩奇病毒B3誘導(dǎo)的心肌炎中,lncRNA HIF1A-AS1的表達(dá)明顯增加,沉默lncRNA HIF1A-AS1可抑制心肌細(xì)胞的凋亡,miR-138是lncRNA HIF1A-AS1的靶基因。Niu等[7]研究發(fā)現(xiàn),OIP5-AS1在心臟缺血再灌注心肌細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào),過表達(dá)OIP5-AS1可減輕活性氧引起的線粒體損傷,降低心肌細(xì)胞的凋亡。OIP5-AS1對細(xì)菌性心肌炎時心肌細(xì)胞的影響及作用機(jī)制尚不明確。

本研究顯示,OIP5-AS1可增加細(xì)菌性心肌炎心肌細(xì)胞的活力,上調(diào)OIP5-AS1可抑制TNF-α和IL-1β炎癥因子的滲出,降低心肌細(xì)胞的凋亡率,減輕心肌細(xì)胞的損傷。越來越多的研究表明,lncRNA主要通過“海綿作用”結(jié)合微小RNA(miRNA),降低miRNA的表達(dá),進(jìn)而抑制miRNA的功能[13-15]。本研究采用生物信息學(xué)軟件Starbase預(yù)測,OIP5-AS1的靶基因可能是miR-181d-5p。雙熒光素素酶報告基因檢測顯示,OIP5-AS1可配對結(jié)合miR-181d-5p。研究表明,miR-181d-5p在急性病毒性心肌病患者血清外泌體中的表達(dá)顯著增加,miR-181d-5p可增強(qiáng)心肌的炎癥反應(yīng),促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡和不可逆損傷[16]。本研究顯示,OIP5-AS1表達(dá)增加后,脂多糖處理的心肌細(xì)胞中miR-181d-5p的表達(dá)降低,OIP5-AS1可明顯抑制miR-181d-5p的表達(dá)。本研究通過Western blot檢測顯示,高表達(dá)OIP5-AS1的心肌細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)增加,Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)減少,提示OIP5-AS1抑制miR-181d-5p表達(dá)后心肌細(xì)胞凋亡明顯減少。

綜上所述,OIP5-AS1可有效增強(qiáng)脂多糖處理的心肌細(xì)胞的活力并抑制其凋亡,OIP5-AS1主要通過抑制miR-181d-5p表達(dá)發(fā)揮作用。本研究首次揭示OIP5-AS1可能有利于改善細(xì)菌性心肌炎心肌細(xì)胞的功能,為細(xì)菌性心肌炎的分子靶向治療提供了新的方向。