陳嘉樂,張 可,杜 楠,鄧 敏

(廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所,廣州 510095;*通訊作者,E-mail:dengmin510095@163.com)

肝癌是常見的惡性腫瘤之一,是全球第五大常見癌癥[1]。肝細胞癌約占全部肝癌的85%-95%[2]。肝細胞癌發(fā)病隱匿,惡性程度高,進展迅速,早期較難發(fā)現(xiàn),很多患者在被診斷有肝細胞癌時都已經(jīng)到達中晚期,預后非常差[3]。且預后在很大程度上受腫瘤分期的影響[4]。因此,找到新的預測肝癌及其預后的生物標志物至關重要。

ALYREF是一個重要的RNA結(jié)合蛋白,是mRNA輸出的關鍵因子之一TREX復合物(TREX)的組成部分之一,TREX復合物包括THO亞復合物、RNA解旋酶UAP56和RNA結(jié)合蛋白ALYREF[5]。有研究[6]表明ALYREF的表達在多種腫瘤中都有改變,但具體研究癌癥與其關系的報道尚少,尤其是與肝癌的發(fā)生發(fā)展的關系尚未見有報道。本研究通過觀察ALYREF表達水平與肝癌患者臨床預后之間的相關性,及敲低ALYREF表達對肝癌細胞的影響,探討其生物學意義。

1 材料與方法

1.1 細胞株、組織標本和主要試劑

人肝癌細胞株MHCC97H來源于廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所細胞庫。肝癌與癌旁組織蠟塊取自廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院病理科,其中肝癌組織90例,癌旁組織20例,病理及資料完善。胰酶、DMEM、血清購自Gibco公司。免疫組化試劑盒購自邁新生物技術開發(fā)有限公司。CCK-8試劑盒購自日本同仁公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000購于美國Thermo Fisher Scientific公司。ALYREF抗體購于美國Abcam公司。本研究通過廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 生物信息學分析

利用在線分析網(wǎng)站UALCAN分析TCGA數(shù)據(jù)庫中371例肝癌組和50例正常對照組ALYREF基因的表達水平與預后信息。同時從CPTAC公開數(shù)據(jù)庫中下載肝癌數(shù)據(jù)集,共159例肝癌患者數(shù)據(jù)及其配對的癌旁數(shù)據(jù)。利用此數(shù)據(jù)集,分析ALYREF在在肝癌患者中蛋白表達和mRNA水平的情況。

1.3 免疫組化檢測ALYREF在正常肝與肝癌組織中的表達情況

組織蠟塊切片、制片后,取需要的切片放進60 ℃恒溫箱中烤片3 h,環(huán)保透明劑脫蠟,梯度乙醇脫水后,用高壓鍋煮沸枸櫞酸鹽溶液進行抗原修復10 min,然后室溫自然冷卻。冷卻后使用即用型免疫組化UltraSensitiveTMSP試劑盒,按說明書進行操作后孵育一抗(ALYREF),放入濕盒中4 ℃過夜。次日室溫復溫30 min,PBS洗3次后,滴加生物素標記的第二抗體,室溫孵育10 min,PBS沖洗3次,滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液,室溫孵育10 min。PBS沖洗3次。然后進行DAB顯色,蘇木素復染,自來水沖洗返藍,1%鹽酸酒精分化后梯度酒精脫水干燥,中性樹膠封固。觀察ALYREF基因表達分布及相對表達量。陽性細胞分數(shù)評定:≤25%,1分;26%-50%,2分;51%-75%,3分;>75%,4分。染色強度評定:無著色,0分;弱性,1分;中等陽性,2分;強陽性,3分?？偟梅譃閮身椃謹?shù)之積,總得分>3分為陽性表達。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染和細胞培養(yǎng)

取對數(shù)生長期MHCC97H細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中,第2天細胞密度到達70%-90%時用Lipofectamine3000試劑盒進行轉(zhuǎn)染。分別將5 μg shALYREF質(zhì)粒和5 μg shControl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入MHCC97H細胞中,以敲低細胞中ALYREF的表達。轉(zhuǎn)染24-72 h后,收集細胞進行Western blot免疫印跡實驗以驗證基因的敲低效果。MHCC97H肝癌細胞轉(zhuǎn)染后分為shALYREF組和shControl組,培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中,放置于37 ℃,5% CO2濕度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 Western blot檢測ALYREF蛋白的表達水平

分別收集shALYREF組和shControl組細胞,用RIPA法裂解后,提取總蛋白,用PierceTMBCA Protein Assay Kit試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。取30 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳。濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶封閉1 h。分別孵育ALYREF單克隆抗體(1 ∶1 000)和β-actin抗體(1 ∶5 000),4 ℃過夜。第2天TBST洗膜3次,每次10 min。孵育特異性二抗2 h后,TBST洗膜3次,每次10 min,之后用ECL化學發(fā)光試劑對X線片顯影,掃描儀掃描膠片。

1.6 Transwell實驗檢測細胞遷移能力

使用不帶基質(zhì)膠的Transwell小室,用胰酶消化shALYREF細胞和shControl細胞,終止消化后1 000 r/min離心5 min,棄培養(yǎng)基,用無FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞,進行細胞計數(shù)。取5×104個細胞放入Transwell小室,加無血清DMEM補至200 μl。Transwell下室加入10% FBS的DMEM培養(yǎng)基600 μl,置于37 ℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,棄上室液體,用甲醇固定30 min,用棉簽擦去上室細胞,加入1%結(jié)晶紫染色15 min,流水洗滌干凈。晾干后拍照,并隨機選取5個視野進行計數(shù)。

1.7 CCK-8實驗檢測敲低ALYREF后對MHCC97H細胞的增殖能力的影響

取shALYREF細胞和shControl細胞,消化后計數(shù),在96孔板中配制100 μl的細胞懸液,每孔細胞數(shù)2×103個,設置5個復孔。將培養(yǎng)板放在37 ℃,5% CO2的培養(yǎng)箱預培養(yǎng)24 h。向每孔加入10 μl CCK-8溶液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4 h。用酶標儀測定在450 nm處的吸光度(OD值)。每天同一時間測定,連續(xù)測定5 d。所得OD值作均一化處理后描繪增殖曲線。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用軟件GraphPad Prism 7.0和SPSS16進行統(tǒng)計學分析,兩組間比較用t檢驗,多組間比較使用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ALYREF在肝癌組織中高表達且與預后相關

在線分析網(wǎng)站UALCAN分析結(jié)果顯示,ALYREF在肝癌組的表達水平高于正常對照組(P<0.05,見圖1A)。且ALYREF的表達水平與肝癌患者組織腫瘤分期相關(P<0.005),臨床分期越高,ALYREF表達越高(見圖1B)。再利用GEPIA網(wǎng)站的分析,數(shù)據(jù)表明ALYREF高表達患者的OS(總生存)比低表達患者短(P=0.001 5,見圖1C)。

圖1 在線網(wǎng)站分析ALYREF在肝癌中的表達及生存分析Figure 1 Expression and survival analysis of ALYREF in hepatocellular carcinoma patients by online website analysis

2.2 ALYREF在肝癌中的蛋白表達和mRNA水平

利用CPTAC公開數(shù)據(jù)庫中的肝癌數(shù)據(jù)集分析ALYREF在肝癌患者中蛋白表達和mRNA水平的情況。結(jié)果顯示肝癌患者癌組織中ALYREF蛋白相對表達量及mRNA水平均高于癌旁組織,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001,見圖2)。

與癌旁組織比較,***P<0.001圖2 公開數(shù)據(jù)分析得ALYREF在肝癌中蛋白質(zhì)和mRNA水平的表達情況Figure 2 Protein and mRNA expression of ALYREF in hepatocellular carcinoma based on open data

2.3 免疫組化驗證ALYREF在肝癌組織及癌旁組織的表達

肝癌組織中ALYREF蛋白陽性表達呈棕黃色或棕褐色,主要位于細胞核中,部分胞漿也可見表達(見圖3)。在肝癌組織中陽性表達率67.8%(61/90),而在癌旁組織中陽性表達率35.0%(7/20),差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=7.448,P<0.005)。

圖3 ALYREF在肝癌組織中的表達Figure 3 Expression of ALYREF in hepatocellular carcinoma

2.4 轉(zhuǎn)染敲低質(zhì)粒shALYREF后MHCC97H細胞中ALYREF的蛋白表達

Western blot檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染后,MHCC97H細胞中ALYREF的表達量明顯降低(見圖4)。

圖4 Western blot檢測MHCC97H細胞ALYREF表達的敲低效果Figure 4 ALYREF expression in MHCC97H cells after transfected wtih shALYREF by Western blot

2.5 敲低ALYREF對肝癌細胞MHCC97H遷移能力的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示,敲低了ALYREF的MHCC97H細胞遷移細胞數(shù)比對照組顯著減少,細胞遷移能力顯著下降,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000 3,見圖5)。

與shControl組比較,***P<0.001圖5 敲低ALYREF對MHCC97H細胞遷移的影響Figure 5 Effect of knocking down ALYREF on migration of MHCC97H cells

2.6 敲低ALYREF對肝癌細胞MHCC97H增殖能力的影響

CCK-8實驗結(jié)果表明,敲低ALYREF后MHCC97H細胞的增殖能力比對照組降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.0001,見圖6)。

與shControl組比較,***P<0.001,****P<0.0001圖6 敲低ALYREF對MHCC97H細胞增殖能力的影響Figure 6 Effect of knocking down ALYREF on the proliferation of MHCC97H cells

3 討論

近年來,肝癌的發(fā)病率增長迅速[7,8],尤其是在中國,肝癌的發(fā)病率和死亡率一直居高不下。嚴重威脅著我國人民的生命健康,目前,肝癌是我國第4位常見惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因[9]。肝癌細胞具有很強的增殖能力,肝癌病情發(fā)展迅速,預后較差,抑制肝癌細胞增殖能力能夠有效提高肝癌的治療效果[10]。一直以來,原發(fā)性肝癌的治療方法包括了肝切除術、肝移植術、局部消融治療、TACE、放射治療、全身治療等多種手段。而手術是主要的治療手段,但是大部分病人確診時已達中晚期,能獲得手術切除機會的病人僅20%-30%[11]。因此,早期診斷以及提前預測肝癌患者預后非常重要,而ALYREF這個基因與肝癌患者的生存預后有著密切相關性。

ALYREF作為一個RNA結(jié)合蛋白,在5′RNA加帽、RNA POL Ⅱ(RNA聚合酶Ⅱ)延伸、轉(zhuǎn)錄剪接和mRNA輸出中起著不同的作用[12,13]。除了作為TREX復合物的組成部分之一,目前ALYREF還被發(fā)現(xiàn)與m5C甲基化密切相關,它是m5C的閱讀蛋白,目前只有兩個m5C閱讀器蛋白被報道:一個是ALYREF,是一個mRNA核質(zhì)輸出因子[14];另一個是YBX1,調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性[15,16]。m5C甲基化修飾是主要的RNA轉(zhuǎn)錄后修飾之一,是一個動態(tài)可逆過程,受到RNA甲基化酶和去甲基化酶調(diào)控,而且甲基化修飾后需要RNA甲基化結(jié)合蛋白的參與才能發(fā)揮生物學作用[17]。mRNA甲基化修飾可調(diào)控腫瘤的發(fā)生,這種轉(zhuǎn)錄后修飾在腫瘤疾病中發(fā)揮著重要作用[15]。mRNAs中m5C的形成主要由RNA甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN2催化和由mRNA輸出接頭ALYREF特異性識別。ALYREF核質(zhì)穿梭依賴于NSUN2的催化活性。mRNA輸出接頭ALYREF是一種特異性的m5C結(jié)合蛋白,促進mRNA輸出方面發(fā)揮了重要作用[14]。選擇性mRNA輸出可以調(diào)節(jié)癌癥發(fā)展中某些重要的生物學過程,如細胞的增殖和基因組的完整性,而且一些癌癥癌可能會增加mRNA的輸出,從而改變蛋白質(zhì)的輸出[18]。ALYREF參與的甲基化過程和mRNA輸出過程都對腫瘤有重要影響。

目前,ALYREF與腫瘤相關的報道尚不多。有研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細胞中敲低ALYREF可抑制其增殖能力[19],在口腔鱗癌中,ALYREF過表達可能與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關[20]。在其他疾病中,ALYREF與肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)和額顳葉癡呆(FTD)相關,它在ALS運動神經(jīng)元中增加,其下調(diào)可能抑制多種ALS和FTD相關基因的毒性[21]。作為m5C閱讀器蛋白ALYREF在調(diào)節(jié)小鼠白血病病毒(MLV)復制方面發(fā)揮著重要作用[22]。

ALYREF與肝癌的相關研究未見報道,本研究通過UALCAN在線網(wǎng)站分析ALYREF在肝癌組織與正常對照組織表達水平的差異以及ALYREF表達水平與臨床預后的相關性,結(jié)果顯示ALYREF在肝癌組織中高表達,且腫瘤分期越高,ALYREF表達水平越高。通過GEPIA分析顯示ALYREF高表達肝癌患者的OS下降。用臨床病理標本進行免疫組化驗證上述結(jié)果,分析證實ALYREF在肝癌組織中高表達。另外使用shRNA技術敲低MHCCH97H細胞株中ALYREF的表達,通過Transwell與CCK-8實驗發(fā)現(xiàn)肝癌細胞的ALYREF表達下調(diào)后,其遷移和增殖能力均降低。這些實驗結(jié)果提示ALYREF對于肝癌可能是一種促癌基因及預測其預后的新的生物標志物。

綜上,ALYREF在肝癌組織和細胞中表達上調(diào),敲低ALYREF的表達可抑制肝癌細胞的遷移和增殖能力。但是關于該基因在肝癌中的機制尚未清楚,所以有必要對該基因進行多層面研究,更全面掌握ALYREF在腫瘤中的作用,為肝癌的預防診治提供更多依據(jù)。