張偉杰, 張若琛, 陳義坤 , 李 岳 , 黃建安

(1. 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科, 江蘇 蘇州, 215006;2. 蘇州大學(xué) 呼吸疾病研究所, 江蘇 蘇州, 215006)

肺癌是一類惡性程度極高的癌癥，在所有癌癥種類中死亡率居首位。在新診斷的肺癌病例中，約85%被診斷為非小細胞肺癌(NSCLC)[1], 患者5年生存率僅為24%, 腺癌(LUAD)是NSCLC的主要組織學(xué)類型[2]。甲基雙加氧酶(TET2)是TET蛋白家族的一員，可催化5-甲基胞嘧啶(5mC)羥基化的酶活性[3]。研究[4]證實TET2的高表達與肝癌、白血病患者的不良預(yù)后相關(guān)，同時TET2可以通過抑制CD86來抑制自身免疫[5-6]。有關(guān)TET2在NSCLC中的作用研究較少，本研究探索TET2對NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響及可能機制，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

人NSCLC細胞株A549、H1299、H460、SPC-A1和人正常支氣管上皮細胞BEAS-2B均從中國上海中科院細胞庫/干細胞庫購買; TET2引物(Genewiz公司); Trizol、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒 (TaKaRa公司); Lip 2 000轉(zhuǎn)染試劑 (Thermo公司); 胎牛血清(Gibco公司); RPMI-1640 培養(yǎng)基(Corning公司); 抗體: TET2(Millipore公司)、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Cyclin D1和β-actin抗體及二抗(CST公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng): A549、H1299、H460、SPC-A1和BEAS-2B均使用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基于培養(yǎng)細胞前均加入10%胎牛血清配制成完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 瞬時轉(zhuǎn)染: 細胞于前1 d鋪板至六孔板中，第2天觀察細胞密度為50%～60%即可進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格按照說明書進行。

1.2.3 細胞內(nèi)TET2 mRNA的檢測: Tizol裂解細胞后提取總 RNA，按照試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄及RT-PCR檢測。TET2 上游引物序列為5′-GATAGAACCAACCATGTTGAGGG-3′, 下游引物序列為5′-TGGAGCTTTGTAGCCAGAGGT-3′。

1.2.4 CCK8和克隆形成實驗: 將轉(zhuǎn)染完成的細胞消化計數(shù)后，按每孔3 000個細胞的密度鋪至96孔板中，并進行CCK8實驗。第2天每孔中加入10 μL CCK8試劑，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，用酶標(biāo)儀測定吸光度差值，繪制增殖曲線。將3 000個細胞加入60 mm培養(yǎng)皿中，約50個集落形成后即中止培養(yǎng)，用甲醇固定細胞后加入結(jié)晶紫染色，計數(shù)克隆數(shù)。

1.2.5 Transwell實驗: 預(yù)先向侵襲實驗的小室中加入基質(zhì)膠，培養(yǎng)箱中孵育2 h。將轉(zhuǎn)染完成的細胞消化計數(shù)，遷移實驗上室中加入40 000個細胞，侵襲實驗加入60 000個，24 h后甲醇固定結(jié)晶紫染色，棉簽擦去未穿透的細胞，于鏡下200倍視野下拍照計數(shù)。

1.2.6 Western blot實驗: 用RIPA提取細胞總蛋白，每60 μL樣品加入16 μL 5×loading buffer和4 μL 二硫蘇糖醇(DTT)。電泳完成后，濕轉(zhuǎn)2 h, 封閉1 h后一抗4 ℃孵育過夜。二抗室溫孵育2 h, 用增強化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影對條帶進行顯色。

1.2.7 流式細胞術(shù): 將轉(zhuǎn)染完成的細胞加入70%乙醇固定過夜，用PI染色液對細胞進行染色，上機進行細胞計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 TET2在NSCLC細胞株中高表達且與患者預(yù)后相關(guān)

在線數(shù)據(jù)庫顯示TET2的高表達與肺腺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，見圖1A。NSCLC細胞株中TET2的mRNA以及蛋白表達量均高于人正常肺上皮細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.001), 見圖1B。

A: TET2表達與總生存率關(guān)系; B: TET2在非小細胞株中的蛋白和mRNA表達水平。n: 肺腺癌患者。**P<0.01, ***P<0.001。圖1 TET2在NSCLC細胞株中高表達且與患者預(yù)后相關(guān)

2.2 敲低TET2可以抑制NSCLC細胞株的增殖能力

瞬時轉(zhuǎn)染si-TET2后，A549和H1299細胞中TET2的mRNA和蛋白表達均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01或P<0.001), 見圖2A; CCK8(圖2B)以及克隆形成(圖2C)結(jié)果提示敲低TET2, NSCLC細胞株增殖能力被顯著抑制(P<0.01或P<0.001)。

A: 瞬時轉(zhuǎn)染si-TET2干擾序列后TET2的mRNA和蛋白表達水平,與NC比較, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; B: CCK8法檢測敲低TET2對細胞增殖能力的影響,與si-TET2-NC比較, **P<0.01, ***P<0.001; C: 克隆形成實驗檢測敲低TET2后對細胞集落形成能力的影響,與NC比較, ***P<0.001。圖2 敲弱TET2可以抑制NSCLC細胞株的增殖能力

2.3 敲弱TET2可以抑制NSCLC細胞株的遷移和侵襲能力

干擾TET2后, A549和H1299細胞的遷移和侵襲能力顯著減弱(P<0.001), 見圖3。

A、B: Transwell實驗檢測干擾 TET2后A549和H1299侵襲和遷移能力的變化(放大倍數(shù)200倍); C: Transwell實驗干擾 TET2后A549和H1299細胞數(shù)柱狀圖。與NC比較, ***P<0.001。圖3 敲弱TET2可以抑制NSCLC細胞株的遷移和侵襲能力

2.4 敲弱TET2阻滯細胞周期于G0/G1期

敲弱TET2可以將細胞阻滯于G0/G1期，并降低S期細胞比例，見圖4。

A、B: 流式細胞術(shù)檢測干擾TET2后A549和H1299細胞周期變化; C: A549、H1299細胞周期的細胞數(shù)柱狀圖。與NC比較, **P<0.01, ***P<0.001。NS: 無顯著性。圖4 敲弱TET2阻滯細胞周期于G0/G1期

2.5 TET2對EMT標(biāo)志物和細胞周期蛋白的影響

在 A549、H1299細胞中，敲低TET2后, N-cadherin、Vimentin和Cyclin D1蛋白的表達顯著下調(diào), E-cadherin的表達顯著上調(diào)，見圖5。

A、B: Western blot法檢測干擾TET2后EMT相關(guān)蛋白和Cyclin D1蛋白變化; C: A549、H1299蛋白印跡條帶灰度掃描后繪制成柱狀圖。與NC比較, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。β-actin: 內(nèi)參基因。圖5 TET2對EMT標(biāo)志物和細胞周期蛋白的影響

3 討 論

TET2作為去甲基化蛋白家族中的一員，已有研究[7]報道同一蛋白家族的TET1在NSCLC中的高表達與患者的不良預(yù)后相關(guān)。TET2在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中均扮演了重要的角色，已有研究[4]證實TET2的高表達與肝癌、白血病患者的不良預(yù)后相關(guān)，同時TET2可以通過抑制CD86來抑制自身免疫[5-6], 但TET2在肺癌中的功能尚未闡明。本研究通過數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)TET2的高表達與NSCLC患者的不良預(yù)后相關(guān)，并證實TET2可以通過調(diào)控細胞周期和EMT進程，促進NSCLC的增殖、遷移和侵襲能力。

TET2作為去甲基化蛋白可以參與甲基化過程，甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，在胞嘧啶的C5位上面加上一個甲基，形成5-甲基胞嘧啶的化學(xué)修飾過程，其過程受甲基化酶和去甲基化酶的嚴(yán)格調(diào)控[8]。甲基化主要發(fā)生在NSCLC的早期階段，研究[9]表明，BALF的SHOX2/RASSF1A甲基化檢測對Ⅰ期的肺癌患者有極高的檢出率，為85.7%, 遠高于血清CEA和細胞學(xué)的10.7%和46.4%。另一項研究[10]通過檢測患者外周血ctDNA中的SHOX2、PTGER4和IDH1的甲基化頻率，證實這3個基因的聯(lián)合診斷效能顯著高于單一標(biāo)志物對肺癌患者的診斷效能。故尋找TET2的甲基化修飾蛋白，發(fā)掘新的NSCLC的甲基化診斷標(biāo)志物，并通過非侵入性手段檢測外周血基因的甲基化頻率，可在提高診斷效能的同時，加強NSCLC的早篩早診，為其診斷提供新的策略。EMT是指上皮細胞丟失原本具有的細胞間的緊密連接，向間質(zhì)細胞的形態(tài)和特性轉(zhuǎn)變的過程[11-12]。研究[13-15]證實, EMT過程可以促進肺癌、黑色素瘤和乳腺癌的轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，干擾TET2后可以逆轉(zhuǎn)EMT進程。EMT在靶向治療后的耐藥研究[16- 17]中同樣被證實具有重要作用，逆轉(zhuǎn)EMT進程對細胞恢復(fù)對靶向藥物的敏感性發(fā)揮重大作用，但TET2在耐藥過程中發(fā)揮的作用本研究并未進一步探索。

綜上所述, TET2在NSCLC細胞株中高表達，并且可以通過影響細胞周期EMT進程，促進NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲，針對此靶點可以為NSCLC的治療和診斷提供新的策略。