盛福梅, 連 旭, 韓崇旭1,

(1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225001; 2. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬六合醫(yī)院 檢驗(yàn)科, 江蘇 南京, 211500;3. 江蘇省蘇北人民醫(yī)院/揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科, 江蘇 揚(yáng)州, 225001)

甲狀腺癌(THCA)是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤。近些年, THCA發(fā)病率快速上升，根據(jù)中國(guó)癌癥中心網(wǎng)2018年統(tǒng)計(jì)[1]顯示, THCA居常見(jiàn)惡性腫瘤的第7位以及女性常見(jiàn)惡性腫瘤的第4位。THCA已成為耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)、腺體外科學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)和腫瘤學(xué)共同的研究熱點(diǎn)[2]。THCA的發(fā)病率以女性居多，學(xué)者們揭示了在THCA發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中有著重要影響的體細(xì)胞基因的改變，但對(duì)相關(guān)基因表達(dá)差異對(duì)THCA發(fā)病影響的研究較少。本研究運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析江蘇省揚(yáng)州地區(qū)THCA患病情況，并用生物信息學(xué)分析篩選參與女性THCA癌變和進(jìn)展的差異表達(dá)基因(DEGs), 以揭示女性THCA發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找具有臨床意義的生物標(biāo)志物，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集江蘇省蘇北人民醫(yī)院2020年1—12月診斷為T(mén)HCA患者的臨床資料，共納入患者1 780例，年齡13～84歲，平均(50.3±11.8)歲。根據(jù)性別分為男性組(n=300)和女性組(n=1 480), 其中男性組年齡13～81歲，平均(52.37±12.70)歲; 女性組年齡13～84歲，平均(49.88±11.60)歲。男性患者占總體的16.85%, 女性患者占83.15%。女性THCA發(fā)病率高于男性，男女發(fā)病的性別比為1∶4.93。

患者均符合美國(guó)甲狀腺學(xué)會(huì)修訂發(fā)布的《成人甲狀腺結(jié)節(jié)與分化型THCA治療指南(2015)》[3]中THCA的診斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究已獲倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批號(hào): 2021ky028)。

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 25.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 數(shù)據(jù)獲取與基因篩選

從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下載基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)GSE329265, 該芯片為Affymetrix人基因組U133 2.0芯片(HGU133_Plus_2, 安捷倫GPL570平臺(tái))。GSE29265數(shù)據(jù)集共包括THCA組織及癌旁正常組織20對(duì)。男性組為男性腫瘤(MT)、男性正常(MN)，女性組為女性腫瘤(FT)、女性正常(FN)。通過(guò)在線(xiàn)工具GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/), 以P<0.05和|logFC|>2對(duì)2組基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。利用Venn軟件(http://bioinformatics.psb. ugent. be/webtools/Venn/)在線(xiàn)獲取各組上調(diào)基因、下調(diào)基因。logFC>0的DEGs被認(rèn)為是上調(diào)基因, logFC<0的DEGs被認(rèn)為是下調(diào)基因。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)與模塊分析

利用數(shù)據(jù)分析軟件STRING(https://string-db. org/cgi/input. pl)分別對(duì)FT和MT差異基因編碼蛋白進(jìn)行相互作用分析(置信度≥0.4, 互作最大值=0), 并建立PPI網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)Cytoscape 3.6.0軟件的MCODE 插件從構(gòu)建的PPI 網(wǎng)絡(luò)中選取連接最緊密的模塊進(jìn)一步分析(設(shè)置參數(shù)為degree=2, node score=0.2, k-core=2, max. depth=100), 模塊所含基因?yàn)殛P(guān)鍵樞紐基因(Hub基因)。

1.5 基因的功能富集

通過(guò)在線(xiàn)DAVID網(wǎng)站(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)DEGs進(jìn)行基因本體(GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)通路富集，分析這些基因的生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組成、分子功能以及主要涉及的腫瘤相關(guān)通路。

2 結(jié) 果

2.1 不同性別THCA年齡分布比較

60歲以下年齡段，男性和女性THCA患病率隨年齡增長(zhǎng)均呈增高趨勢(shì)(男性趨勢(shì)χ2=191.1,P<0.000 1; 女性趨勢(shì)χ2=562.2,P<0.000 1), 女性THCA 40～49歲年齡段的分布高于男性, ≥60歲年齡段的分布低于男性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 )。見(jiàn)表1。

表1 不同性別THCA年齡分布比較[n(%)]

2.2 THCA及正常組織中差異表達(dá)基因

通過(guò)在線(xiàn)工具GEO2R和Venn分析，在MT中檢測(cè)到165個(gè)差異倍數(shù)達(dá) 4 倍以上的顯著DEGs, 包括70個(gè)上調(diào)基因和95個(gè)下調(diào)基因; 在FT中檢測(cè)到163個(gè)顯著DEGs, 包括83個(gè)上調(diào)基因和80個(gè)下調(diào)基因，見(jiàn)圖1。2組共有55個(gè)上調(diào)差異基因, 59個(gè)下調(diào)差異基因，見(jiàn)圖2。

A: 男性組; B: 女性組。

A: MT、FT上調(diào)差異表達(dá)基因; B: MT、FT下調(diào)差異表達(dá)基因。MT: 男性腫瘤; FT: 女性腫瘤。

2.3 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)及篩選鑒定Hub基因

分別將MT、FT中篩選獲得的164、190個(gè)差異基因輸入到STRING網(wǎng)站，構(gòu)建各自PPI 網(wǎng)絡(luò)(圖3A、圖4A), 然后用Cytoscape軟件中MCODE 插件提取PPI 網(wǎng)絡(luò)中連接最為緊密的模塊基因。MT中評(píng)分最高的模塊包含了8個(gè)基因，共形成了28種相互作用關(guān)系，為MT的Hub基因(圖3B)。FT中具有最高連接度的模塊包含了10個(gè)Hub基因，共形成25種相互作用關(guān)系(圖4B)。結(jié)果顯示, Hub基因中有SERPINA1、FN1、CHRDL1和GPC34種基因在2組同時(shí)存在，其中SERPINA1、FN1為上調(diào)基因,CHRDL1、GPC3為下調(diào)基因;APOE、TIMP1、FAM20A和CDH2在MT中獨(dú)立存在，均為上調(diào)基因; 而PROM1、EVA1A、PRSS23、ITGA2、NCAM1和KIT這6個(gè)基因在FT中獨(dú)立存在，其中PROM1、NCAM1與KIT為下調(diào)基因,EVA1A、PRSS23和ITGA2為上調(diào)基因，提示性別因素對(duì)THCA的發(fā)病機(jī)制存在一定影響。

A: PPI網(wǎng)絡(luò); B: 模塊分析。圖3 男性DEGs構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)和模塊分析

A: PPI網(wǎng)絡(luò); B: 模塊分析。圖4 女性DEGs構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)和模塊分析

2.4 THCA女性組Hub基因GO功能注釋及KEGG信號(hào)通路分析

GO分析表明THCA女性組Hub基因:ITGA2、FN1、NCAM1參與細(xì)胞黏附生物學(xué)過(guò)程;KIT、FN1參與基因表達(dá)的正調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程。SERPINA1、FN1、GPC3、PROM1、PRSS23與細(xì)胞外泌體細(xì)胞組分相關(guān);FN1、PROM1與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體中間區(qū)室細(xì)胞組分相關(guān)。SERPINA1、KIT主要分子功能為蛋白酶結(jié)合。KEGG分析顯示FT中DEGs主要富集于3條信號(hào)通路，富集于蛋白聚糖腫瘤信號(hào)通路的基因有ITGA2、GPC3、FN1; 富集于PI3K-Akt信號(hào)通路的基因有ITGA2、KIT、FN1; 富集于癌癥信號(hào)通路的基因?yàn)镮TGA2、KIT、FN1。

3 討 論

THCA是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌惡性腫瘤，約占所有內(nèi)分泌惡性腫瘤的90%。流行病學(xué)研究[1]發(fā)現(xiàn)，女性THCA患病率顯著高于男性，其原因尚不明確?；蛲蛔兪荰HCA發(fā)生發(fā)展的重要因素之一，并與其疾病診斷、預(yù)后評(píng)估及分子靶向藥物治療密切相關(guān)。

本研究分析揚(yáng)州地區(qū)1 780例THCA患者臨床資料，發(fā)現(xiàn)女性THCA發(fā)病率高于男性，男、女發(fā)病的性別比為1∶4.93。60歲以下人群中，男、女THCA患病率隨年齡增長(zhǎng)均呈增高趨勢(shì)。女性THCA 40～49歲年齡段的分布高于男性, ≥60歲年齡段的分布卻低于男性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。研究[4]顯示女性THCA患病率約為男性的3倍，并發(fā)現(xiàn)雌激素可能是甲狀腺良惡性細(xì)胞的一種有效生長(zhǎng)因子。RUBIO G A等[5]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后雌激素受體α表達(dá)增加可能與甲狀腺乳頭狀癌的侵襲有關(guān)，這與本研究結(jié)果一致，女性THCA的發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)逐漸增加，絕經(jīng)后開(kāi)始呈下降趨勢(shì)。本研究篩選女性組和男性組內(nèi)差異表達(dá)基因，建立各自組內(nèi)的PPI網(wǎng)絡(luò)，從中將聯(lián)系最緊密的一個(gè)模塊基因提取出來(lái)作為關(guān)鍵基因研究。篩選2組共同表達(dá)的差異基因，并鑒定為非性別差異性基因, 4個(gè)為MT特有基因, 6個(gè)FT特有基因。6個(gè)FT特有基因?yàn)?KIT、EVA1A、ITGA2、NCAM1、PROM1和PRSS23, 其表達(dá)水平變化可能在女性THCA的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。

KIT基因編碼Ⅲ型受體酪氨酸激酶，其在造血、黑色素的生成、精子的生成以及Cajal間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育中起多種作用，并已證實(shí)其激活突變與多種腫瘤類(lèi)型相關(guān)[6-7]。研究[8]表明，與良性甲狀腺組織相比，甲狀腺惡性病變中的KIT基因表達(dá)降低，這與本研究中女性組KIT基因低表達(dá)一致。在正常甲狀腺上皮轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞的過(guò)程中,KIT基因表達(dá)低下，提示該基因可能參與甲狀腺細(xì)胞的分化和腫瘤的進(jìn)展。EVA1A基因位于染色體2p12, 是一種新型的溶酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白表達(dá)基因，參與自噬和細(xì)胞凋亡[9]。研究[10-11]證明,EVA1A基因在肝細(xì)胞癌和非小細(xì)胞肺癌中低表達(dá)，且通過(guò)自噬、凋亡抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。在結(jié)腸腺癌以及彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中，癌組織中的EVA1A基因表達(dá)明顯高于在正常組織中的表達(dá)。LIN B Y[12]等發(fā)現(xiàn)EVA1A是增強(qiáng)THCA侵襲性的有效癌基因。

ITGA2基因編碼整合素蛋白α2, 該蛋白與β亞基形成異源二聚體，主要介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)，在腫瘤浸潤(rùn)、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[13]。研究[14-16]表明ITGA2的表達(dá)與癌癥的轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)，許多組學(xué)研究已將ITGA2作為胃癌、前列腺癌及乳腺癌早期診治及預(yù)后分析的潛在分子標(biāo)志物。CHERNAYA G等[17]發(fā)現(xiàn)在甲狀腺乳頭狀癌(PTC )組織中,ITGA2基因表達(dá)水平高于正常甲狀腺組織，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)侵襲性PTC中miR-16的下調(diào)導(dǎo)致ITGA2基因表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)腫瘤的入侵和遷移。 神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(NCAM1)是一種膜蛋白表達(dá)基因，主要在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)。實(shí)驗(yàn)[18-19]發(fā)現(xiàn),NCAM1異常表達(dá)與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，如急性髓細(xì)胞性白血病和小細(xì)胞肺癌[19]。NCAM1同樣存在于正常甲狀腺組織的濾泡上皮細(xì)胞中, GOLU I等[20]發(fā)現(xiàn)NCAM1的表達(dá)可使PTC與非腫瘤性病變的其他甲狀腺疾病區(qū)分開(kāi)，具有非常好的敏感性，并認(rèn)為標(biāo)志物NCAM1在診斷PTC時(shí)，具有評(píng)估邊界病變的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

由PROM1基因編碼的CD133是一種戊聚糖跨膜糖蛋白，具有作為泛癌靶標(biāo)的巨大潛力，其通常與包括THCA在內(nèi)的多種不同腫瘤類(lèi)型的癌癥干細(xì)胞有關(guān)[21-22]。研究[23]發(fā)現(xiàn)，乙酰膽堿通過(guò)激活CD133-Akt途徑增高CD133的表達(dá)量，從而提高THCA細(xì)胞的自我更新和免疫逃逸能力。PRSS23是一種新發(fā)現(xiàn)的絲氨酸蛋白酶基因，與多種類(lèi)型的癌癥進(jìn)展有關(guān)，如卵巢癌、胃癌[24-25], 敲低PRSS23基因可抑制EIF2信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而在體內(nèi)外抑制胃癌的生長(zhǎng)。目前暫未有研究發(fā)現(xiàn)PRSS23與THCA的相關(guān)性。上述均提示該6個(gè)基因與THCA有較為密切的聯(lián)系本研究進(jìn)一步運(yùn)用GO和KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)女性組DEGs對(duì)細(xì)胞黏附、基因表達(dá)的正調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程有一定影響，并參與PI3K-Akt、蛋白聚糖腫瘤、癌癥等信號(hào)通路的調(diào)控。PI3K-Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑被認(rèn)為是癌癥的主要調(diào)控因子[26]。研究[27]表明, Akt 作為PI3K-Akt信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，可使細(xì)胞周期激酶抑制劑失活，從而促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)及腫瘤的生成。同時(shí)，該通路的異?；罨龠M(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化及轉(zhuǎn)移。因此，監(jiān)測(cè)該通路可有助于預(yù)測(cè)女性THCA的進(jìn)展。

綜上所述，本研究分析了揚(yáng)州地區(qū)THCA患者的臨床資料，篩選出THCA性別差異基因，有助于闡明女性THCA發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，并為潛在的生物標(biāo)志物提供理論依據(jù)，但后續(xù)還需分子生物學(xué)研究來(lái)驗(yàn)證結(jié)果。