李英蓮, 陳富強(qiáng), 王 靜, 劉 虹, 顏 鑫, 陳劍鋒

(山東省血液中心 檢驗(yàn)科, 山東 濟(jì)南, 250014)

隨著酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑質(zhì)量的不斷改進(jìn)和采供血系統(tǒng)核酸檢測(cè)全覆蓋的實(shí)現(xiàn)，為適應(yīng)血站技術(shù)的發(fā)展需求，國(guó)家衛(wèi)生健康委對(duì)《血站技術(shù)操作規(guī)程(2015 版)》進(jìn)行修改完善，制定了《血站技術(shù)操作規(guī)程(2019 版)》(以下簡(jiǎn)稱《規(guī)程》)?！兑?guī)程》對(duì)血液檢測(cè)項(xiàng)目和方法中的檢測(cè)策略進(jìn)行了調(diào)整，規(guī)定人類免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染標(biāo)志物應(yīng)至少采用核酸和血清學(xué)試劑檢測(cè)各1次。目前，血站實(shí)驗(yàn)室一般根據(jù)試劑說明書來設(shè)定試驗(yàn)參數(shù)，以被測(cè)物的吸光度值/臨界值(S/CO值)判定結(jié)果，若說明書未建議設(shè)置灰區(qū)，則將S/CO值≥1判為反應(yīng)性, S/CO值<1判為陰性。為降低弱陽性樣本漏檢率，有些實(shí)驗(yàn)室主動(dòng)將結(jié)果反應(yīng)性判定值下調(diào)，設(shè)置不同的灰區(qū)，但國(guó)家衛(wèi)生管理部門對(duì)試劑的灰區(qū)設(shè)置并無統(tǒng)一規(guī)定，各血站對(duì)同一廠家試劑可能設(shè)定不一，有些實(shí)驗(yàn)室則不設(shè)置。由于《規(guī)程》確定了對(duì)HIV、HBV、HCV這3種病原體實(shí)施1遍ELISA檢測(cè)策略的合法性，本研究對(duì)2017年本中心參加的國(guó)家衛(wèi)計(jì)委臨床檢驗(yàn)中心牽頭組織的“血液篩查試劑多中心評(píng)估項(xiàng)目”所得部分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行分析，探討2種乙型肝炎表面抗原(HBsAg)ELISA 試劑設(shè)置灰區(qū)的必要性及設(shè)定范圍，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 研究資料

樣本總數(shù)為3 383份，其中HBsAg陽性樣本387份(原國(guó)家衛(wèi)計(jì)委臨床檢驗(yàn)中心提供)，陰性樣本2 996份(濟(jì)南地區(qū)日常無償獻(xiàn)血者樣本)。

1.2 儀器與試劑

STAR自動(dòng)化樣本處理系統(tǒng)(Microlab STAR，瑞士Hamilton公司)，全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)(Microlab FAME2420/2430，瑞士Hamilton公司); 上海一家生物有限公司生產(chǎn)的HBsAg診斷試劑盒(ELISA法，以下稱“國(guó)產(chǎn)試劑”)，意大利Diasorin公司生產(chǎn)的HBsAg診斷試劑盒Murex HBsAg Version 3(ELISA法，以下稱“進(jìn)口試劑”); 中和試驗(yàn)試劑為羅氏試劑(美國(guó))和雅培試劑(美國(guó))，化學(xué)發(fā)光試劑為羅氏(美國(guó))化學(xué)發(fā)光試劑和安圖(中國(guó))生物化學(xué)發(fā)光試劑。

1.3 檢測(cè)方法

按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)操作和衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心對(duì)血清盤的檢測(cè)要求，使用4種試劑對(duì)樣本進(jìn)行平行檢測(cè)，灰區(qū)下限分別設(shè)置為臨界值(CO值)的0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0倍(即S/CO值分別為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0)，根據(jù)不同反應(yīng)性判定值對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判定。

1.4 樣本最終結(jié)果的確定

4種試劑檢測(cè)結(jié)果均呈反應(yīng)性(S/CO值≥1.0)的樣本，判為陽性，反之則判為陰性; 當(dāng)4種試劑出現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果不一致時(shí)，挑出樣本進(jìn)行雙孔復(fù)檢，若有任何1種試劑1孔或2孔呈反應(yīng)性(S/CO值≥1.0)則判為可疑，送衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心進(jìn)行確認(rèn)，以反饋結(jié)果為準(zhǔn)。臨床檢驗(yàn)中心使用雅培/羅氏公司的化學(xué)發(fā)光法試劑、雅培/羅氏公司的化學(xué)發(fā)光法中和試驗(yàn)試劑、索林公司的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑和核酸檢測(cè)(NAT)技術(shù)進(jìn)行補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)和/或確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)算不同S/CO值下試劑的約登指數(shù)，約登指數(shù)=(靈敏度+特異度)-1, 以S/CO值為橫坐標(biāo)、約登指數(shù)為縱坐標(biāo)繪制曲線。

2 結(jié) 果

2.1 HBsAg陽性樣本檢測(cè)情況

423份HBsAg陽性樣本中, S/CO值為1.0時(shí)，國(guó)產(chǎn)試劑出現(xiàn)46份假陰性，進(jìn)口試劑出現(xiàn)28份假陰性，同時(shí)使用2種試劑時(shí)出現(xiàn)假陰性25份。S/CO值≥0.3時(shí)，進(jìn)口試劑的靈敏度均高于國(guó)產(chǎn)試劑，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 423份HBsAg陽性樣本檢測(cè)結(jié)果

2.2 日常陰性樣本檢測(cè)情況

平行檢測(cè)日常樣本2 997份，其中1份樣本4種試劑檢測(cè)均呈反應(yīng)性(S/CO值≥1.0), 不納入本次分析范圍。21份單試劑反應(yīng)性樣本送衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心檢測(cè)，反饋結(jié)果均為陰性，故陰性樣本合計(jì)2 996份。S/CO值為0.2～1.0時(shí), 2種試劑的特異度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 2 996份日常陰性樣本檢測(cè)結(jié)果

2.3 約登指數(shù)

國(guó)產(chǎn)試劑在最大約登指數(shù)(0.957)時(shí)的S/CO值為0.4, 進(jìn)口試劑在最大約登指數(shù)(0.971)時(shí)的S/CO值為0.7, 見表3。

表3 2種試劑在不同S/CO值下的靈敏度、特異度及約登指數(shù)比較

3 討 論

《規(guī)程》中制訂的有關(guān)獻(xiàn)血者血液的檢測(cè)策略，是各血站必須遵守的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，是預(yù)防經(jīng)輸血傳播相關(guān)傳染病和確保臨床用血安全的重要技術(shù)規(guī)范?！兑?guī)程》檢測(cè)策略中規(guī)定, HIV、HBV和HCV感染標(biāo)志物應(yīng)至少采用核酸和血清學(xué)試劑各進(jìn)行1次檢測(cè)。根據(jù)該檢測(cè)策略，血站可對(duì)HIV、HBV和HCV這3種病原體實(shí)施1遍ELISA檢測(cè)，目前各血站對(duì)于采取何種措施來確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性持有不同意見，但選擇一種靈敏度高的試劑以及設(shè)置合適的灰區(qū)防止弱陽性樣本的漏檢是大多數(shù)血站的考慮重點(diǎn)。京津冀15家血站的獻(xiàn)血者及血液檢測(cè)策略中, 14家血站實(shí)驗(yàn)室在ELISA檢測(cè)時(shí)設(shè)定了灰區(qū)，范圍為0.5～0.9, 其中乙肝第1種試劑使用實(shí)驗(yàn)室12家，設(shè)置灰區(qū)0.5～0.7的有7家，占試劑使用實(shí)驗(yàn)室總數(shù)的58.3%(7/12)[1]。ELISA灰區(qū)是實(shí)驗(yàn)室為檢出弱陽性樣本而自行設(shè)定的，能夠降低試劑因分析靈敏度較低帶來的漏檢風(fēng)險(xiǎn)，但灰區(qū)的設(shè)定也會(huì)不可避免地增加一些假陽性結(jié)果，浪費(fèi)掉原本合格的血液樣本。

約登指數(shù)代表一種試劑檢測(cè)真陽性與真陰性的總能力，其兼顧靈敏度和特異度，是分析血液篩查試劑檢測(cè)性能的一種常用指標(biāo)，指數(shù)越大表示真實(shí)度越高。雖然血液篩查試劑最重要的指標(biāo)是靈敏度，但應(yīng)用時(shí)也要考慮特異度，為了避免增加更多的假陽性，臨床可以對(duì)檢測(cè)出來的反應(yīng)性樣本補(bǔ)充確證試驗(yàn)，若為陰性則放行。

國(guó)家衛(wèi)健委臨床檢驗(yàn)中心對(duì)2018年第一季度全國(guó)26個(gè)省(市、自治區(qū))61家血站實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行分析，使用本次評(píng)價(jià)的國(guó)產(chǎn)試劑的血站有18家，其中1家設(shè)置灰區(qū)下限為0.5倍CO值, 4家設(shè)為0.7倍CO值, 5家設(shè)為0.8倍CO值, 3家設(shè)為0.9倍CO值，另外5家未設(shè)置灰區(qū)。本研究檢測(cè)了423份HBsAg陽性樣本，國(guó)產(chǎn)試劑在約登指數(shù)(0.957)最大(灰區(qū)下限為0.4倍CO值)時(shí)有11份陽性漏檢，進(jìn)口試劑在約登指數(shù)(0.971)最大(灰區(qū)下限為0.7倍CO值)時(shí)有4份漏檢，由此可見，若實(shí)施1遍HBV ELISA檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)選用試劑的灰區(qū)范圍進(jìn)行評(píng)估。目前血站操作規(guī)程和相關(guān)文件并未規(guī)定試劑的灰區(qū)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室按照試劑使用說明書設(shè)定或自行設(shè)定，如國(guó)內(nèi)有13家血站實(shí)驗(yàn)室使用了本次評(píng)估的國(guó)產(chǎn)試劑，其中1家設(shè)定S/CO值為0.7, 1家設(shè)為0.8, 6家設(shè)為0.9, 另外5家未設(shè)置灰區(qū)。

洛陽市中心血站在106份灰區(qū)(S/CO值為0.6～<1.0)樣本中檢出12 份陽性，說明ELISA法檢測(cè)出的“灰區(qū)”標(biāo)本中存在一定數(shù)量的陽性標(biāo)本[2]。張秀慧等[3]對(duì)蚌埠市中心血站采集的136份灰區(qū)(S/CO值為0.7～<1.0)樣本進(jìn)行確認(rèn)，發(fā)現(xiàn)10份呈陽性，表明了灰區(qū)設(shè)置的必要性。王慶敏等[4]對(duì)國(guó)內(nèi)常用的7種HBsAg ELISA檢測(cè)試劑盒灰區(qū)臨界值進(jìn)行研究，同樣認(rèn)為有必要設(shè)置灰區(qū)，但要結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力先進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證，然后確定反應(yīng)性判定值范圍，并認(rèn)為反應(yīng)性判定值設(shè)定為S/CO值≥0.3(國(guó)產(chǎn)試劑)、S/CO值≥0.6(進(jìn)口試劑)為宜。陳洪生等[5]分析了2011—2013年解放軍寧波血站發(fā)現(xiàn)的25份灰區(qū)(S/CO值為0.3～1.0)樣本確證結(jié)果，發(fā)現(xiàn)S/CO值為0.3～0.5的標(biāo)本，驗(yàn)證試驗(yàn)沒有陽性，達(dá)到0.7時(shí)出現(xiàn)1份陽性。但北京市紅十字血液中心檢驗(yàn)科的一項(xiàng)研究[6]卻認(rèn)為，灰區(qū)不可能解決“窗口期”問題，引入更高級(jí)的檢測(cè)技術(shù)才是關(guān)鍵，其試驗(yàn)結(jié)果支持取消灰區(qū)設(shè)置。另外一項(xiàng)研究[7]也表明，血清免疫逃逸變異 HBsAg是導(dǎo)致HBsAg ELISA灰區(qū)的重要原因，提升變異 HBsAg檢測(cè)能力有助于臨床診斷。

NAT技術(shù)能夠有效縮短病毒檢測(cè)的“窗口期”，進(jìn)一步提升用血安全性。中國(guó)于2010年開始對(duì)血液篩查的NAT技術(shù)進(jìn)行評(píng)估，《血站技術(shù)操作規(guī)程(2015年版)》將NAT納入血液檢測(cè)方法中，實(shí)現(xiàn)全國(guó)血站NAT全覆蓋, ELISA檢測(cè)與NAT技術(shù)各具優(yōu)勢(shì)，互為補(bǔ)充，兩者聯(lián)檢可有效降低輸血感染風(fēng)險(xiǎn)，且對(duì)HBV DNA的檢出率極高[8-13], 避免了許多窗口期和隱匿性HBV感染者的血液制品流向臨床。

NAT與HBsAg血清學(xué)ELISA檢測(cè)陽性結(jié)果也存在不一致情況，深圳市血液中心對(duì)236 例乙肝中和試驗(yàn)確證陽性樣本進(jìn)行核酸檢測(cè), NAT檢出率為71.2%(168/236)[14], 而廣州地區(qū)HBsAg(+)/NAT(-)獻(xiàn)血者在無償獻(xiàn)血者中的比率為0.19%, 在HBsAg雙試劑確認(rèn)陽性獻(xiàn)血者中的比率為24.87%[15]。此外，陳顯等[16]在28 份HBsAg灰區(qū)樣本中檢出7份陽性，且S/CO值為0.5～<0.6區(qū)域3份，對(duì)其中4名獻(xiàn)血者于獻(xiàn)血3個(gè)月后追蹤隨訪, 3名確證試驗(yàn)陽性但NAT陰性，說明NAT技術(shù)在提升HBsAg灰區(qū)樣本的檢出率方面并無優(yōu)勢(shì)，另外各NAT系統(tǒng)的檢出率也不相同[17], 故血站也應(yīng)重視血液篩查試劑的選擇和質(zhì)量控制。本次評(píng)估的國(guó)產(chǎn)試劑的說明書中未設(shè)置灰區(qū)，進(jìn)口試劑則規(guī)定S/CO值為0.90, 按照說明書規(guī)定值0.90進(jìn)行判定, 423例陽性樣本國(guó)產(chǎn)試劑漏檢44例，進(jìn)口試劑漏檢18例，所以若實(shí)施1遍ELISA檢測(cè)，進(jìn)口試劑為首選，但需要對(duì)灰區(qū)樣本進(jìn)一步確認(rèn)，以甄別其中的假陽性，為獻(xiàn)血者回告和歸隊(duì)提供依據(jù)。