孫嘉偉，盧秀，王燕

1濟(jì)南市第四人民醫(yī)院，濟(jì)南 250031；2上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院

在全球范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌是最常見的癌癥類型之一［1］。在結(jié)直腸癌的早期階段（即Ⅰ、Ⅱ期），患者可以接受手術(shù)和治愈性治療，其5年生存率大于60%。但是，超過50%的患者發(fā)現(xiàn)時已處于晚期，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險較高，而這些患者的5年生存率降至10%［2］。由于轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是癌癥治療失敗的主要原因，因此開發(fā)用于預(yù)防和治療癌癥轉(zhuǎn)移的新型藥物至關(guān)重要。川陳皮素是一種在柑橘類水果中發(fā)現(xiàn)的多甲氧基類黃酮，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗高血壓和抗菌等作用，對腫瘤細(xì)胞的生長、遷移和侵襲表現(xiàn)一定的抑制活性［3-5］。研究發(fā)現(xiàn)，川陳皮素及其衍生物通過靶向癌癥進(jìn)展中的多種途徑，阻滯細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、防止腫瘤形成、減少炎癥作用和限制血管生成［6］，但其具體的作用機(jī)制尚未完全闡明。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類大于200個核苷酸的非編碼RNA，研究發(fā)現(xiàn)lncRNA LINC00116在宮頸癌中高表達(dá)，敲除LINC00116可抑制癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲［7］。然而，LINC00116在結(jié)直腸癌中的生物學(xué)作用研究較少。本研究觀察了川陳皮素對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，并對其潛在的分子機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心，RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司。細(xì)胞HCT116在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37℃、5%CO2的環(huán)境中生長。川陳皮素（純度≥98%）購自成都曼斯特生物科技有限公司，磷脂酰結(jié) 合 蛋白V-FITC（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司，二辛可寧酸（BCA）試劑盒購自上海碧云天公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、P21、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）、E-鈣黏蛋白（Ecadherin）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）一抗購自美國Cellular Signaling Technology公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞增殖情況觀察 采用MTT法。將細(xì)胞HCT116以1×104/孔的密度接種到96孔板中，并分別使用0、10、20、40μg/mL川陳皮素處理48 h。每孔加入100μL 0.5 mg/mL MTT溶液，在37℃保持4 h。將反應(yīng)得到的沉淀物溶于100μL二甲基亞砜中，用酶標(biāo)儀在490 nm處測定細(xì)胞光密度（OD）值，計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)OD值/對照OD值×100%。

1.3 細(xì)胞克隆形成檢測 采用克隆實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞HCT116以0、10、20、40μg/mL川陳皮素處理48 h，之后將細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿，在新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞10～14 d，每4～5 d更換1次培養(yǎng)基。當(dāng)出現(xiàn)≥50個細(xì)胞集落時，磷酸鹽緩沖液洗滌3次，甲醇固定20 min和吉姆薩染色30 min，統(tǒng)計克隆形成數(shù)。

1.4 細(xì)胞凋亡情況觀察 使用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒對細(xì)胞凋亡進(jìn)行評估。收集0、10、20、40μg/mL川陳皮素處理48 h的細(xì)胞HCT116。在細(xì)胞HCT116的單細(xì)胞懸液（1×106/mL）中加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI，在室溫下于黑暗處孵育15 min。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.5 細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測 細(xì)胞HCT116用0、10、20、40μg/mL川陳皮素處理48 h，之后收獲細(xì)胞，以Transwell小室法檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力。檢測細(xì)胞侵襲時，Transwell上室用100μL的Matrigel膠包被，靜置3～4 h（檢測細(xì)胞遷移時不加Matrigel膠）。將細(xì)胞HCT116重懸于無血清RPMI1640培養(yǎng)基，制成1×106/mL的密度，接種100μL于Transwell上室，并在下室添加含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)24 h后，除去上室的Matrigel膠和細(xì)胞，甲醛固定和結(jié)晶紫染色，統(tǒng)計遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.6 細(xì)胞中P21、Caspase-3、E-cadherin、MMP-2蛋白檢測 采用Western blotting法。0、10、20、40μg/mL川陳皮素處理細(xì)胞HCT116后，用預(yù)冷細(xì)胞裂解緩沖液冰上提取總蛋白，經(jīng)BCA試劑盒定量，取30μg的蛋白在10%SDS-PAGE凝膠上分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜，在5%脫脂牛奶中封閉1 h。然后用1∶1 000稀釋的P21、Caspase-3、E-cadherin、MMP-2和GAPDH（對照）的一抗，在4℃下孵育過夜。TBST洗滌10 min，3次后將PVDF膜與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗孵育1 h，膜用TBST清洗10 min，3次后用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光法顯影蛋白條帶。在ImageJ軟件中通過光密度分析法檢測P21、Caspase-3、E-cadherin、MMP-2蛋白。

1.7 細(xì)胞中LINC00116表達(dá)檢測 采用實(shí)時熒光定量PCR。根據(jù)TRIzol試劑說明提取細(xì)胞HCT116的總RNA。參照TaKaRa公司Reverse Transcription Reagent試劑盒的步驟將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)使用引物和SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行。LINC00116引物序列為5'-CATGGCGGATGTGTCAGAGA-3'（正向），5'-GCCTCCTTTTCCTCCAGTCC-3'（反向）；內(nèi)參U6引物序列為5'-CTCGCTTCGGCAGCACATATACTA-3'（正向），5'-ACGAATTTGCGTGTCATCCTTGCG-3'（反向）。使 用2-ΔΔCt法 計 算LINC00116相對表達(dá)量。

1.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞HCT116接種于6孔板，分為si-NC組、si-LINC00116組、NOB+pcDNA3.1組、NOB+pcDNA3.1-LINC00116組。細(xì)胞匯合至70%左右時，按照Lipofectamine2000試劑說明書的步驟，在細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-LINC00116、pcDNA3.1、pcDNA3.1-LINC00116。轉(zhuǎn)染24 h后，NOB+pcDNA3.1組、NOB+pcDNA3.1-LINC00116組使用40μg/mL川陳皮素處理48 h。依照1.2～1.7所述方法檢測各項(xiàng)指標(biāo)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，兩組間比較采用配對t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 川陳皮素對細(xì)胞HCT116增殖、凋亡的影響見表1。

表1 不同濃度川陳皮素對細(xì)胞HCT116增殖、凋亡的影響（±s）

表1 不同濃度川陳皮素對細(xì)胞HCT116增殖、凋亡的影響（±s）

注：與0時相比，*P＜0.05。

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2.2 川陳皮素對細(xì)胞HCT116遷移、侵襲的影響 見表2。

表2 不同濃度川陳皮素對細(xì)胞HCT116遷移、侵襲的影響（±s）

表2 不同濃度川陳皮素對細(xì)胞HCT116遷移、侵襲的影響（±s）

注：與0時相比，*P＜0.05。

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2.3 川陳皮素對細(xì)胞HCT116中LINC00116表達(dá)的影響 0、10、20、40μg/mL川陳皮素處理細(xì)胞HCT116中的LINC00116相對表達(dá)量分別為1.02±0.10、0.78±0.08、0.56±0.05、0.34±0.03，川陳皮素減少細(xì)胞HCT116中LINC00116的表達(dá)（P均＜0.05）。

2.4 抑制LINC00116對細(xì)胞HCT116增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響 si-NC組、si-LINC00116組LINC00116相對表達(dá)量分別為1.03±0.10、0.28±0.03，兩組相比P＜0.05。抑制LINC00116對細(xì)胞HCT116增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響見表3、4。

表3 抑制LINC00116對細(xì)胞HCT116增殖、凋亡的影響（±s）

表3 抑制LINC00116對細(xì)胞HCT116增殖、凋亡的影響（±s）

注：與si-NC組相比，*P＜0.05。

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表4 抑制LINC00116對細(xì)胞HCT116遷移、侵襲的影響（±s）

表4 抑制LINC00116對細(xì)胞HCT116遷移、侵襲的影響（±s）

注：與si-NC組相比，*P＜0.05。

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2.5 過表達(dá)LINC00116對川陳皮素作用的細(xì)胞HCT116增殖、凋亡的影響 NOB+pcDNA3.1組、NOB+pcDNA3.1-LINC00116組LINC00116相對表達(dá)量分別為1.00±0.10、2.36±0.23，兩組相比P＜0.05。過表達(dá)LINC00116對川陳皮素作用的細(xì)胞HCT116增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響見表5、6。

表5 過表達(dá)LINC00116對川陳皮素作用的細(xì)胞HCT116增殖、凋亡的影響（±s）

表5 過表達(dá)LINC00116對川陳皮素作用的細(xì)胞HCT116增殖、凋亡的影響（±s）

注：與NOB+pcDNA3.1組相比，*P＜0.05。

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表6 過表達(dá)LINC00116對川陳皮素作用的細(xì)胞HCT116遷移、侵襲的影響（±s）

表6 過表達(dá)LINC00116對川陳皮素作用的細(xì)胞HCT116遷移、侵襲的影響（±s）

注：與NOB+pcDNA3.1組相比，*P＜0.05。

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3 討論

結(jié)直腸癌是一種常見的胃腸道惡性腫瘤，也是人類癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一［8］。罹患結(jié)直腸癌的風(fēng)險與個人特征或習(xí)慣（如年齡、慢性病史和生活方式）多種危險因素相關(guān)［9］。在臨床實(shí)踐中，手術(shù)、化療和放療仍然是結(jié)直腸癌的主要治療策略［10］。但是，結(jié)直腸癌患者的預(yù)后仍然很差，特別是對于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者［11］。因此，開發(fā)新的抗腫瘤藥物是結(jié)直腸癌管理策略的重點(diǎn)。天然化合物已被用于治療癌癥多年，其毒副作用比非天然抗癌藥物少。然而，天然來源的藥物缺乏特定的靶標(biāo)［12］。因此，研究天然產(chǎn)物的靶向治療極具意義。本文研究了一種天然黃酮類化合物——川陳皮素，它可充當(dāng)針對各種癌癥的抗癌劑。

以往的研究已經(jīng)證明了川陳皮素在多種腫瘤細(xì)胞系和腫瘤模型如膀胱癌、肺癌和前列腺癌中的生長抑制作用［13-15］。川陳皮素的抗癌功能包括抑制增殖、遷移、侵襲和血管生成，如川陳皮素以劑量和時間依賴的方式抑制人鼻咽癌C666-1細(xì)胞的活力，以劑量依賴的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［16］，還可顯著抑制鼻咽癌HONE-1和NPC-BM細(xì)胞系的遷移、侵襲能力，下調(diào)MMP-2表達(dá)［17］。川陳皮素的代謝物與他汀類藥物通過誘導(dǎo)G0/G1細(xì)胞周期停滯和凋亡而協(xié)同抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的生長［18］。本研究中，川陳皮素減少細(xì)胞HCT116的存活率、克隆形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、MMP-2蛋白表達(dá)，提高細(xì)胞凋亡率及P21、Caspase-3、E-cadherin蛋白表達(dá)，且作用效果隨濃度增加而逐漸增強(qiáng)。川陳皮素顯現(xiàn)出一定的抗結(jié)直腸癌活性，可以下調(diào)MMP-2和上調(diào)P21、Caspase-3、E-cadherin表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡，進(jìn)而發(fā)揮其抗腫瘤作用，這提示富含川陳皮素的藥物可能在結(jié)直腸癌的治療中有一定的前景。

lncRNA在多種細(xì)胞過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，例如細(xì)胞增殖、凋亡、分化和侵襲［19］。隨著對結(jié)直腸癌發(fā)病相關(guān)分子機(jī)制的深入研究，lncRNA被認(rèn)為是結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)控因子［20-22］。LINC00116是新發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，編碼高度保守的56個氨基酸的微蛋白［23］。LINC00116編碼連接呼吸和脂質(zhì)代謝的線粒體肽［24］，與脊椎關(guān)節(jié)炎/強(qiáng)直性脊柱炎密切相關(guān)［25］，然而對于LINC00116的生物學(xué)功能研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制LINC00116降低細(xì)胞HCT116的細(xì)胞存活率、克隆形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、MMP-2蛋白表達(dá)，增加細(xì)胞凋亡率及P21、Caspase-3、E-cadherin蛋白表達(dá)，表明抑制LINC00116可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，與LAI等［7］的研究一致。同時，抑制LINC00116還可誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡?？梢奓INC00116是一種促癌lncRNA，抑制其表達(dá)將有助于阻礙結(jié)直腸癌的惡性進(jìn)展。為了揭示川陳皮素的抗腫瘤機(jī)制，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中檢測了LINC00116的表達(dá)及作用。發(fā)現(xiàn)不同濃度的川陳皮素減少細(xì)胞HCT116中LINC00116的表達(dá)，提示調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞中LINC00116的表達(dá)可能是川陳皮素發(fā)揮抗腫瘤作用的重要途徑。此外，過表達(dá)LINC00116增加川陳皮素作用的細(xì)胞HCT116的細(xì)胞存活率、克隆形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、MMP-2蛋白表達(dá)，降低凋亡率及P21、Caspase-3、E-cadherin蛋白表達(dá)。這些結(jié)果說明，川陳皮素抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)其凋亡的作用可能是通過下調(diào)LINC00116的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，川陳皮素可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。抑制LINC00116同樣具有抗結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。另外，川陳皮素抗結(jié)直腸癌活性與調(diào)控LINC00116的表達(dá)有關(guān)。這為結(jié)直腸癌的治療策略提供了新的線索。