陳晨，李晶，葉婷，李惠

新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，烏魯木齊 830000

2017年全球約有4.51億糖尿病患者，預(yù)計(jì)到2045年，糖尿病患者人數(shù)將增加到6.93億，同時(shí)，接近一半（49.7%）的糖尿病患者未得到診斷［1］。糖尿病腎病是糖尿病常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，主要為腎小球和腎小管微血管病變，主要表現(xiàn)為持續(xù)性蛋白尿和腎小球?yàn)V過(guò)率進(jìn)行性下降［2］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-92b-3p可通過(guò)靶向糖尿病腎病大鼠中的Smad7介導(dǎo)晚期糖基化終產(chǎn)物（RAGE）誘導(dǎo)的腎臟異常發(fā)育［3］。而同屬于miR-92b家族的miR-92b-5p最早被發(fā)現(xiàn)與心房顫動(dòng)和心衰等心臟疾病關(guān)系密切［4］，但有關(guān)糖尿病腎病患者miR-92b-5p表達(dá)情況及其與糖尿病腎病發(fā)病的關(guān)系目前尚未闡明。高遷移率族蛋白Box1（HMGB1）是一種分布在腎臟等重要器官高度保守的非組蛋白核蛋白，其作為促炎細(xì)胞因子，可通過(guò)激活Toll樣受體（TLR）2、TLR4或RAGE而介導(dǎo)多種炎性疾病的發(fā)生和發(fā)展［5-6］。HMGB1通過(guò)介導(dǎo)RAGE的產(chǎn)生和增加NF-κB的激活而誘發(fā)糖尿病大鼠的腎臟損傷［7］，因此阻斷HMGB1及其受體之間相互作用可預(yù)防糖尿病腎病的發(fā)展。鑒于此，本研究旨在探討血清中miR-92b-5p及HMGB1在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，并分析其對(duì)糖尿病腎病的診斷及預(yù)測(cè)價(jià)值，為糖尿病腎病的診斷及治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年1—12月及2020年4—7月于我院就診的203例2型糖尿病患者為研究對(duì)象，其中男92例、女111例，年齡26～80（62.44±10.81）歲，依據(jù)是否合并腎病將患者分為單純糖尿病組（n=98）和糖尿病腎病組（n=105），并納入80例同期體檢健康者為對(duì)照組，其中男41例、女39例，年齡（63.10±10.80）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：2型糖尿病患者符合《中國(guó)2型糖尿病防治指南（2017年版）》［8］中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；2型糖尿病腎病的診斷根據(jù)《糖尿病腎病防治專家共識(shí)（2014年版）》［9］符合以下兩者之一即可：①糖尿病視網(wǎng)膜病變伴任何一期慢性腎臟病，②白蛋白尿；受試者年齡在18～80歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：其他類型糖尿病或合并原發(fā)性或其他繼發(fā)性腎臟病；近期患急性感染性疾病；近期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑；合并惡性腫瘤等其他嚴(yán)重疾??；有透析史或腎移植病史。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象簽署知情同意書。

1.2 一般情況及常規(guī)檢驗(yàn)指標(biāo)收集 完整記錄各組年齡、性別、高血壓史、BMI、飲酒史、吸煙史，并記錄入院時(shí)的實(shí)驗(yàn)室常規(guī)化驗(yàn)指標(biāo)，包括膽固醇（TC）、甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、空腹血糖（FBG）、24 h尿蛋白（24 hpro）、肌酐，計(jì)算估算腎小球?yàn)V過(guò)率（eGFR）=［（140-年齡）×體質(zhì)量（kg）×88.4］/［72×肌酐（mmol/L）］（女性×0.85）。

1.3 血清miR-92b-5p和HMGB1檢測(cè) 采集所有受試者空腹血9 mL，加入EDTA管中，血清的分離工作于4 h內(nèi)完成，以4℃3 000 r/min（離心半徑8 cm），離心15 min，分離血清，后將其轉(zhuǎn)移至無(wú)RNA酶及DNA酶的EP管中，并存于-80℃冰箱備用。HMGB1采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)，ELISA試劑盒購(gòu)自武漢優(yōu)爾生科技公司，依照提供的說(shuō)明書完成檢測(cè)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-92b-5p mRNA：將血清從-80℃冰箱取出置于冰上解凍，采用TRIzol裂解液（Invitrogen公司，美國(guó)）對(duì)血清提取總RNA，之后采用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）將提取出的總RNA按500 ng體系（反應(yīng)條件為37℃15 min、85℃5 s），逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；取1μL cDNA、10μL SYBR Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa公司，日本）和1μL miR-92b-5p特異性引物按20μL體系，使用Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR系統(tǒng)（Thermo Fisher，新加坡）進(jìn)行擴(kuò)增。miR-92b-5p的循環(huán)條件：95℃30 s，95℃5 s，60℃34 s，40個(gè)循環(huán)。miR-92b-5p上游引物序列為5'-AGGGACGGGACGCGGTGCAGTG-3'，下游引物序列為5'-GCGAFCACAGAATTAATACGAC-3'；內(nèi)參基因U6上游引物序列為5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物序列為5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。每個(gè)樣品重復(fù)3次上樣，采用2-ΔΔCt法測(cè)定miR-92b-5p的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示（經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)并符合正態(tài)分布時(shí)），兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，多組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)因素分析采用多因素Logistic回歸分析；預(yù)測(cè)價(jià)值根據(jù)繪制的ROC曲線進(jìn)行分析，采用Pearson檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組臨床特征比較 見表1。

表1 各組臨床特征比較

2.2 2型糖尿病患者進(jìn)展為糖尿病腎病的危險(xiǎn)因素分析 將表1中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的指標(biāo)進(jìn)行多因素Logistic回歸分析（α入=0.05，α出=0.10），以是否合并腎病為因變量，以HbA1c、FBG、24 hpro、eGFR、肌酐、miR-92b-5p及HMGB1水平為自變量。結(jié)果顯示，HMGB1和24 hpro水平升高與miR-92b-5p和eGFR水平降低均是2型糖尿病患者進(jìn)展為糖尿病腎病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P均＜0.05），見表2。

表2 2型糖尿病患者是否合并腎病的危險(xiǎn)因素分析

2.3 2型糖尿病患者血清miR-92b-5p、HMGB1與24 hpro、eGFR的相關(guān)性 2型糖尿病患者血清mi R-92b-5p水平與HMGB1（r=-0.297）和24 hpro（r=-0.388）水平均呈負(fù)相關(guān)，miR-92b-5p與eGFR（r=0.406）水平呈正相關(guān)；HMGB1和24 hpro（r=0.573）水平均呈正相關(guān)，與eGFR（r=-0.601）水平呈負(fù)相關(guān)（P均＜0.05）。

2.4 血清miR-92b-5p和HMGB1對(duì)2型糖尿病腎病的預(yù)測(cè)價(jià)值 根據(jù)ROC曲線分析結(jié)果，miR-92b-5p對(duì)應(yīng)的最佳診斷閾值為2.967，敏感性為82.9%、特異性為63.7%；HMGB1對(duì)應(yīng)的最佳診斷閾值為72.08μg/L，敏感性為72.4%，特異性為90.8%；二者聯(lián)合對(duì)2型糖尿病患者進(jìn)展為糖尿病腎病的預(yù)測(cè)價(jià)值均高于miR-92b-5p（Z=2.208，P=0.027）或HMGB1（Z=2.327，P=0.030）單一檢測(cè)，見表3。

表3 血清miR-92b-5p和HMGB1對(duì)2型糖尿病腎病的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討論

隨著肥胖患者數(shù)量的增加，2型糖尿病的患病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，大約25%的2型糖尿病患者可進(jìn)展為糖尿病腎病，其是終末期腎病的主要原因［10］。糖尿病腎病的常見病理特征包括細(xì)胞外基質(zhì)蛋白聚集，系膜細(xì)胞增生、肥大以及腎小球足細(xì)胞功能障礙［6］。糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜且缺乏有效的診斷方法，常規(guī)檢測(cè)手段存在一定的局限性，例如目前臨床對(duì)糖尿病腎病的診斷和監(jiān)測(cè)試驗(yàn)包括尿白蛋白和eGFR，但在蛋白尿發(fā)生之前約有三分之一的患者腎功能下降，因此單獨(dú)檢測(cè)蛋白尿不足以監(jiān)測(cè)糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展［11］，故尋找新的糖尿病腎病診斷性標(biāo)志物或發(fā)病的危險(xiǎn)因素，并進(jìn)行早期識(shí)別和治療對(duì)防治糖尿病腎病至關(guān)重要。

miRNA通過(guò)識(shí)別靶基因的3′-UTR而誘導(dǎo)靶基因的降解，可抑制蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程，調(diào)節(jié)多種生理反應(yīng)及病理過(guò)程。既往研究發(fā)現(xiàn)miRNA可參與調(diào)節(jié)機(jī)體的生長(zhǎng)與分化、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血管生成等，與炎癥、內(nèi)分泌疾病等多種疾病關(guān)系密切［12］。而miRNA對(duì)機(jī)體的病理生理變化反應(yīng)靈敏且性質(zhì)穩(wěn)定，提示其可作為疾病診斷及預(yù)后評(píng)估的新型標(biāo)志物［12］。近期研究發(fā)現(xiàn)miR-92b在腎臟多種病理生理過(guò)程中發(fā)揮作用，例如其可靶向調(diào)控水通道蛋白2而減輕腎水腫［13］，miR-92b-5p最早在心房顫動(dòng)和心衰等心臟疾病中被發(fā)現(xiàn)，而在脊髓損傷模型中發(fā)現(xiàn)miR-92b-5p表達(dá)水平與IL-18結(jié)合蛋白的表達(dá)相關(guān)，繼而通過(guò)調(diào)控IL-18來(lái)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)［14］。IL-18在腎組織中表達(dá)，并在包括高血糖在內(nèi)的多種刺激下上調(diào)。而炎癥反應(yīng)可直接破壞腎臟結(jié)構(gòu)，在糖尿病腎病的病理生理過(guò)程中起重要作用，其中IL-18較IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子-α和巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1等其他炎性因子在糖尿病腎病發(fā)病中所起作用更具特異性，IL-18表達(dá)與糖尿病腎病的進(jìn)展及尿白蛋白排泄率呈正相關(guān)［15］。因此我們推測(cè)miR-92b-5p與糖尿病腎病的發(fā)病可能存在相關(guān)性。HMGB1是一種作為基因表達(dá)輔助因子的核蛋白，幾乎在所有細(xì)胞類型中普遍存在。在細(xì)胞核中HMGB1通過(guò)以非特異性序列方式結(jié)合DNA來(lái)支持染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，并參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA修復(fù)和細(xì)胞分化等多種生物學(xué)功能，其主要細(xì)胞受體是RAGE，而RAGE在包括心臟、腎臟、大腦、嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種組織和細(xì)胞中均有表達(dá)，HMGB1通過(guò)與RAGE結(jié)合而發(fā)揮促炎、促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲等多種生物學(xué)作用［6］。HMGB1表達(dá)升高可激活如CDC42/Rac、MAPK/NF-κB等炎癥信號(hào)通路而加重腎臟的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度升高［16］；研究表明，高血糖可誘導(dǎo)HMGB1從活化的腎細(xì)胞中釋放并刺激RAGE受體和TLR4而發(fā)揮促炎作用，引起腎小管間質(zhì)炎癥而導(dǎo)致腎損傷，最終導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)生［17-18］。上述研究提示，糖尿病患者mi R-92b-5p水平降低及HMGB1表達(dá)升高誘發(fā)的炎癥反應(yīng)可能在糖尿病腎病發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果顯示，2型糖尿病腎病患者的HMGB1水平高于單純糖尿病患者和體檢健康者，而mi R-92b-5p水平低于單純糖尿病患者和體檢健康者。進(jìn)一步Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者HMGB1水平升高與mi R-92b-5p水平降低是其進(jìn)展為糖尿病腎病的危險(xiǎn)因素。既往研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病發(fā)生時(shí)，HMGB1由受損腎組織釋放并在腎細(xì)胞胞質(zhì)中高表達(dá)，且HMGB1水平高低與腎臟炎癥和氧化應(yīng)激水平成正相關(guān)，升高的HMGB1可激活MAPK/NF-κB、TLR等多種炎癥信號(hào)通路共同參與糖尿病腎病炎性損傷的發(fā)病機(jī)制［7，16，19］。研究發(fā)現(xiàn)在大鼠糖尿病腎病模型中，miR-92b-5p表達(dá)降低而HMGB1表達(dá)升高，模型鼠24 hpro、尿素氮和血清肌酐水平均升高，HE染色觀察到腎小球系膜和基底膜小管炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)程度明顯升高并伴明顯的增生和腫脹，進(jìn)而該研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-92b-5p可顯著抑制含有野生型HMGB1質(zhì)粒的螢光素酶活性，提示miR-92b-5p表達(dá)升高可靶向下調(diào)HMGB1的表達(dá)［20］，因此當(dāng)miR-92b-5p表達(dá)降低時(shí)可靶向上調(diào)HMGB1的表達(dá)，繼而激活與HMGB1相關(guān)的炎癥反應(yīng)信號(hào)通路，參與糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展。同時(shí)本研究相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)miR-92b-5p與HMGB1水平呈負(fù)相關(guān)，且mi R-92b-5p、HMGB1與24 hpro、eGFR均有一定的相關(guān)性，說(shuō)明miR-92b-5p降低導(dǎo)致HMGB1水平升高可能通過(guò)導(dǎo)致腎小球系膜和基底膜小管炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)程度升高繼而導(dǎo)致基底膜小管和腎小球系膜增生和腫脹，最終導(dǎo)致尿白蛋白的升高和腎小球?yàn)V過(guò)率的下降。進(jìn)一步ROC曲線結(jié)果顯示血清miR-92b-5p和HMGB1水平對(duì)2型糖尿病患者進(jìn)展為糖尿病腎病有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，且二者聯(lián)合對(duì)2型糖尿病進(jìn)展為糖尿病腎病的預(yù)測(cè)價(jià)值高于單獨(dú)檢測(cè)，提示早期聯(lián)合檢測(cè)兩指標(biāo)可作為臨床預(yù)測(cè)2型糖尿病腎病發(fā)生及進(jìn)展的標(biāo)志物。

綜上所述，血清HMGB1水平升高和miR-92b-5p水平降低是2型糖尿病向糖尿病腎病進(jìn)展的危險(xiǎn)因素，早期聯(lián)合檢測(cè)兩指標(biāo)可作為輔助預(yù)測(cè)2型糖尿病腎病發(fā)生的標(biāo)志物。但本研究為單中心、小樣本研究，需擴(kuò)大樣本量并開展多中心研究進(jìn)一步驗(yàn)證研究結(jié)果。