孟曉京，劉亞軍，項(xiàng)寧

秦皇島市第一醫(yī)院，河北秦皇島 066000

眾所周知，心血管疾病是全世界最致命的疾病。缺血再灌注（I/R）損傷是最常見的心血管疾病病理因素［1］。目前，非編碼RNA［包括微小RNA（miRNA）和長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）］在心肌I/R損傷機(jī)制研究中已成為熱門［2］。研究顯示，lncRNA FGD5-AS1在牙周炎患者中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可減輕脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞損傷［3］。lncRNA FGD5-AS1在糖氧剝奪誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷中低表達(dá)，其過(guò)表達(dá)可減輕糖氧剝奪誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷［4］。miR-421在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)其表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡從而減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷［5］。但lncRNA FGD5-AS1在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中的表達(dá)與功能研究較少。2018年11月—2020年6月，本研究利用缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞，復(fù)制心肌I/R損傷模型，考察lncRNA FGD5-AS1在其中的表達(dá)及其對(duì)心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠心肌細(xì)胞H9C2購(gòu)自上海生物科學(xué)研究所細(xì)胞資源中心，PrimeScript RT、SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，MiScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、MiScript SYBR-Green PCR試劑盒購(gòu)自德 國(guó)Qiagen公 司，pcDNA、pcDNA-FGD5-AS1、anti-miR-NC、anti-miR-421、si-NC、si-FGD5-AS1、miRNC、miR-421購(gòu)自上海GenePharma公司，丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）的檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)公司，膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD Pharmingen公司，細(xì)胞裂解緩沖液購(gòu)自上海Sangon Biotech公司，pMIR GLO載體、雙熒光素酶活性測(cè)定系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與缺氧/復(fù)氧處理 心肌細(xì)胞在補(bǔ)充了10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）中于37℃、5%CO2中培養(yǎng)。取心肌細(xì)胞，將其分為Con組和H/R組。Con組未進(jìn)行處理；H/R組進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理，即將心肌細(xì)胞在缺氧培養(yǎng)箱（95%N2、5%CO2）中缺氧培養(yǎng)3 h，然后在常規(guī)培養(yǎng)箱（95%空氣、5%CO2）中復(fù)氧培養(yǎng)4 h［6］。

1.3 心肌細(xì)胞lncRNA FGD5-AS1和miR-421檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR。用TRIzol試劑提取Con組、H/R組細(xì)胞的總RNA。使用PrimeScript RT試劑盒或MiScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，SYBR Premix Ex TaqⅡ或MiScript SYBR-Green PCR試劑盒在7900HT實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行PCR，lncRNA FGD5-AS1以GAPDH為內(nèi)參，miR-421以U6為內(nèi)參。lncRNA FGD5-AS1引物序列分別為5'-AACAGTGCCTATGTGGACGG-3'（正向）和5'-CCCATCACAGAGGTCCACAC-3'（反向）；miR-421引物序列分別為5'-GCGCGGATCAACAGACATTAATT-3'（正向）和5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'（反向）；GAPDH引物序列分別為5'-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3'（正向）和5'-TTACTCCTTGGAGGCCATGT-3'（反向）；U6引物序列分別為5'-CGCTTCGGCAGCACATATACTAA-3'（正向）和5'-TATGGAACGCTTCACGAATTTGC-3'（反向）。PCR反應(yīng)條件：95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，40個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt法計(jì)算lncRNA FGD5-AS1和miR-421的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞分組及處理 將心肌細(xì)胞分為Con組、H/R組、H/R+pcDNA組、H/R+pcDNA-FGD5-AS1組、H/R+anti-miR-NC組、H/R+anti-miR-421組、pcDNA組、pcDNA-FGD5-AS1組、si-NC組、si-FGD5-AS1組、H/R+pcDNA-FGD5-AS1+miR-NC組、H/R+pcDNA-FGD5-AS1+miR-421組。按照制造商的說(shuō)明使用Lipofectamine2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，按照1.3采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。隨后，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康膮⒄?.2進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理。Con組未處理，H/R組以缺氧/復(fù)氧處理，H/R+pcDNA組進(jìn)行pcDNA轉(zhuǎn)染與缺氧/復(fù)氧處理，H/R+pcDNA-FGD5-AS1組進(jìn)行pcDNA-FGD5-AS1轉(zhuǎn)染與缺氧/復(fù)氧處理，H/R+anti-miR-NC組進(jìn)行anti-miRNC轉(zhuǎn)染與缺氧/復(fù)氧處理，H/R+anti-miR-421組進(jìn)行anti-miR-421轉(zhuǎn)染與缺氧/復(fù)氧處理，pcDNA組轉(zhuǎn)染pcDNA，pcDNA-FGD5-AS1組轉(zhuǎn)染pcDNA-FGD5-AS1，si-NC組轉(zhuǎn)染si-NC，si-FGD5-AS1組轉(zhuǎn)染si-FGD5-AS1，H/R+pcDNA-FGD5-AS1+mi R-NC組同時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA-FGD5-AS1、miR-NC并進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理，H/R+pcDNA-FGD5-AS1+miR-421組同時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA-FGD5-AS1、miR-421并進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理。

1.5 心肌細(xì)胞MDA含量和SOD、GSH-Px活性檢測(cè) 根據(jù)MDA、SOD、GSH-Px檢測(cè)試劑盒的操作步驟，收集1.4各組心肌細(xì)胞上清液，以硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA含量，氮藍(lán)四唑顯色法檢測(cè)SOD活性，NADPH法檢測(cè)GSH-Px活性。

1.6 心肌細(xì)胞凋亡率測(cè)算 采用流式細(xì)胞術(shù)。將1.4各組心肌細(xì)胞在冰冷的PBS液中洗滌兩次，1 000 r/min離心10 min，然后加入100μL結(jié)合緩沖液?；旌虾?，添加5μL Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）。將心肌細(xì)胞在室溫下黑暗中孵育15 min，補(bǔ)充400μL結(jié)合緩沖液，并使用BD Pharmingen流式細(xì)胞儀測(cè)量細(xì)胞凋亡。FlowJo軟件分析凋亡數(shù)據(jù)。

1.7 心肌細(xì)胞抗B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）檢測(cè) 采用Western blotting法。將1.4各組心肌細(xì)胞在細(xì)胞裂解緩沖液中裂解以提取總蛋白。用12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離等量的蛋白質(zhì)（50μg），然后將蛋白凝膠轉(zhuǎn)移到制備的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。選擇5%脫脂脫脂牛奶/TBST來(lái)封閉所有PVDF膜，膜與抗B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）和GAPDH一抗（1：1 000稀釋）在4℃孵育過(guò)夜，隨后與二抗一起孵育。以增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行蛋白信號(hào)檢測(cè)。

1.8 lncRNA FGD5-AS1與miR-421靶向調(diào)控驗(yàn)證 采用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。根據(jù)從LncBase Predicted v.2獲得的數(shù)據(jù)，預(yù)測(cè)出lncRNA FGD5-AS1部分核苷酸序列可與miR-421互補(bǔ)配對(duì)。分別擴(kuò)增包括假定的miR-421結(jié)合序列的lncRNA FGD5-AS1兩種類型（野生型WT、突變體MUT）序列，然后將擴(kuò)增的序列克隆到pMIR GLO載體中，以產(chǎn)生熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒WT-FGD5-AS1或MUT-FGD5-AS1。然后，使用Lipofectamine2000將熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒WT-FGD5-AS1或MUT-FGD5-AS1和miR-421或miR-NC共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h，選擇雙熒光素酶活性測(cè)定系統(tǒng)評(píng)估每組熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧/復(fù)氧對(duì)心肌細(xì)胞損傷的影響 H/R組lncRNA FGD5-AS1的相對(duì)表達(dá)量（0.45±0.04）低于Con組（1.00±0.06），miR-421的相對(duì)表達(dá)量（3.21±0.27）高于Con組（1.00±0.05），P均＜0.05。缺氧/復(fù)氧對(duì)心肌細(xì)胞損傷的影響見表1。

表1 缺氧/復(fù)氧對(duì)心肌細(xì)胞損傷的影響（±s）

表1 缺氧/復(fù)氧對(duì)心肌細(xì)胞損傷的影響（±s）

注：與Con組比較，*P＜0.05。

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2.2 lncRNA FGD5-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響 H/R+pcDNA組、H/R+pcDNAFGD5-AS1組lncRNA FGD5-AS1的相對(duì)表達(dá)量分別為0.42±0.04、1.78±0.14，H/R+pcDNA組與H/R+pcDNA-FGD5-AS1組相比，P＜0.05。lncRNAFGD5-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響見表2。

表2 lncRNA FGD5-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響（±s）

表2 lncRNA FGD5-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響（±s）

注：與H/R+pcDNA組比較，*P＜0.05。

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2.3 抑制miR-421表達(dá)對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響 H/R+anti-miR-NC組、H/R+anti-miR-421組mi R-421的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.05、0.30±0.03，兩者比較P＜0.05。抑制miR-421表達(dá)對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響見表3。

表3 抑制miR-421表達(dá)對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響（±s）

表3 抑制miR-421表達(dá)對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響（±s）

注：與H/R+anti-mi R-NC組比較，*P＜0.05。

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2.4 lncRNA FGD5-AS1靶向調(diào)控miR-421的表達(dá) WT-FGD5-AS1與miR-421共轉(zhuǎn)染的熒光素酶活性（0.51±0.04）低于WT-FGD5-AS1與miR-NC共轉(zhuǎn) 染（1.03±0.08），P＜0.05。MUT-FGD5-AS1與miR-421、miR-NC共轉(zhuǎn)染的熒光素酶活性分別為1.04±0.06、1.01±0.07，兩者相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。pcDNA-FGD5-AS1組、pcDNA組mi R-421相對(duì)表達(dá)量分別為0.35±0.04、1.00±0.06，兩者相比P＜0.05；si-FGD5-AS1組、si-NC組mi R-421相對(duì)表達(dá)量分別為2.99±0.22、1.01±0.04，兩者相比P＜0.05。

2.5 lncRNA FGD5-AS1、miR-421表達(dá)上調(diào)對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的作用 見表4。與H/R+pcDNA-FGD5-AS1+mi R-NC組（1.00±0.07）比較，H/R+pcDNA-FGD5-AS1+miR-421組心肌細(xì)胞miR-421相對(duì)表達(dá)量（2.61±0.22）增加（P＜0.05）。lncRNA FGD5-AS1、miR-421表達(dá)上調(diào)對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響見表4。

表4 lncRNA FGD5-AS1、miR-421表達(dá)上調(diào)對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響（±s）

表4 lncRNA FGD5-AS1、miR-421表達(dá)上調(diào)對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響（±s）

注：與H/R+pcDNA-FGD5-AS1+miR-NC組比較，*P＜0.05。

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3 討論

心肌I/R損傷是一種常見的圍手術(shù)期并發(fā)癥，增加患者病死率。在缺氧期間，尤其是在復(fù)氧階段，氧化應(yīng)激和活性氧的大量增加激活了線粒體的凋亡程序，觸發(fā)了半胱天冬酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡［7-8］。心肌細(xì)胞凋亡有助于心肌I/R損傷后心肌細(xì)胞的丟失并抑制左心室的重塑，并且心肌細(xì)胞凋亡的增加與心肌I/R損傷后心力衰竭的發(fā)生呈正相關(guān)［9］。因此，心肌細(xì)胞的凋亡是導(dǎo)致心肌I/R損傷后心力衰竭的關(guān)鍵促進(jìn)因素［10］。抑制心肌細(xì)胞的凋亡對(duì)于預(yù)防和治療心肌I/R損傷具有重要意義。眾所周知，MDA是氧化應(yīng)激標(biāo)記，SOD和GSH-Px是抗氧化酶，檢查它們的水平可以評(píng)估細(xì)胞的氧化應(yīng)激［11］。本項(xiàng)研究中，缺氧/復(fù)氧使心肌細(xì)胞中SOD活性、GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表達(dá)減少，并使MDA含量、凋亡率、Bax蛋白表達(dá)增多，與之前研究［11］一致，表明缺氧/復(fù)氧處理心肌細(xì)胞成功誘導(dǎo)心肌I/R損傷。

lncRNA可以在表觀遺傳、翻譯或轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。越來(lái)越多的研究表明，lncRNA在心血管疾病的發(fā)病機(jī)制中，尤其是在心肌梗死和I/R損傷中起重要作用［12］。lncRNA不僅起miRNA海綿的作用，還通過(guò)調(diào)節(jié)下游靶點(diǎn)參與心肌細(xì)胞的自噬、細(xì)胞凋亡和壞死［13］。此外，組織特異性和穩(wěn)定表達(dá)的特性使lncRNA有望成為疾病診斷的生物標(biāo)志物［14］。lncRNA FGD5-AS1是非小細(xì)胞肺癌［15］、結(jié)直腸癌［16］、口腔癌［17］等腫瘤的致癌因子，在癌癥中高表達(dá)，可以促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞增殖，結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而抑制FGD5-AS1具有抑制口腔癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲，但促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用［15-17］。lncRNA FGD5-AS1在牙周炎中失調(diào)［18］，被確定為急性心肌梗死的關(guān)鍵lncRNA［19］，但lncRNA FGD5-AS1在心肌I/R損傷中的生物學(xué)功能仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA FGD5-AS1在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9C2中表達(dá)下調(diào)。lncRNA FGD5-AS1過(guò)表達(dá)時(shí)，缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的MDA含量、凋亡率、Bax蛋白表達(dá)降低，SOD活性、GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表達(dá)升高。這些數(shù)據(jù)支持lncRNA FGD5-AS1是心肌I/R的保護(hù)分子，其作用是通過(guò)減少細(xì)胞凋亡和改善氧化應(yīng)激來(lái)發(fā)揮的。

lncRNA的已知功能包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、結(jié)合蛋白和mi RNA海綿，與各種心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。lncRNA上存在大量的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，這些結(jié)合位點(diǎn)通過(guò)堿基互補(bǔ)與目標(biāo)miRNA的特定序列特異性結(jié)合，從而充當(dāng)miRNA海綿［20］，如miR-107［15］、miR-302e［16］是lncRNA FGD5-AS1促進(jìn) 非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌進(jìn)展的功能性靶標(biāo)。miR-421此前已被證明在腦I/R損傷中高表達(dá)，下調(diào)miR-421表達(dá)可減少神經(jīng)功能缺損和梗死體積，并可下調(diào)MDA含量，上調(diào)SOD活性，促進(jìn)髓樣細(xì)胞白血病-1和Bcl-2的表達(dá)，并下調(diào)缺血皮質(zhì)中Bax的表達(dá)。下調(diào)miR-421表達(dá)通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激減輕腦I/R損傷［21］。miR-421敲低導(dǎo)致缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡減少，乳酸脫氫酶和MDA水平降低以及SOD水平升高［5］。WANG等［22］證明miR-421通過(guò)靶向Pink1來(lái)調(diào)節(jié)線粒體片段化和心肌梗死。此外，使用antagomir敲低miR-421可抑制心肌細(xì)胞中的線粒體片段化和凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-421的表達(dá)上調(diào)，抑制miR-421表達(dá)可以降低缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的MDA含量、凋亡率、Bax蛋白表達(dá)，提高SOD活性、GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表達(dá)，與前人研究［5］相符。基于生物學(xué)信息分析、熒光素酶報(bào)告測(cè)定和PCR的測(cè)定，本研究確定了lncRNA FGD5-AS1與miR-421的靶向關(guān)系。另外，上調(diào)miR-421表達(dá)后，lncRNA FGD5-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用被逆轉(zhuǎn)，表現(xiàn)為共轉(zhuǎn)染pcDNA-FGD5-AS1和mi R-421提高缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的MDA含量、凋亡率、Bax蛋白表達(dá)，降低SOD活性、GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表達(dá)。這說(shuō)明在缺氧/復(fù)氧條件下，lncRNA FGD5-AS1對(duì)心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的調(diào)控作用是通過(guò)靶向miR-421來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

總之，lncRNA FGD5-AS1在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中下調(diào)，lncRNA FGD5-AS1過(guò)表達(dá)降低細(xì)胞凋亡，減輕氧化應(yīng)激，其可能是lncRNA FGD5-AS1通過(guò)靶向調(diào)控mi R-421的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。這些結(jié)果為探索急性心肌梗死的新型分子靶向療法提供了有用的信息。