孫 東，陳 琪，朱 博，段美娜

（1.廣東海洋大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510632；3.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621010）

有害藻華（harmful algal blooms,HABs）頻發(fā)于世界各地沿海，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、旅游業(yè)等造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，甚至威脅到海洋生態(tài)安全和人類健康，已經(jīng)成為國(guó)際社會(huì)共同關(guān)注的重大海洋環(huán)境問題和生態(tài)災(zāi)害[1-2]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，HABs 在全球范圍內(nèi)每年可造成約80 億美元的經(jīng)濟(jì)損失[3]。米氏凱倫藻（Karenia mikimotoi）是一種典型的有害甲藻，是一種常見的魚毒性赤潮藻，屬于甲藻門，裸甲藻目，凱倫藻屬，分布廣泛，常在太平洋沿岸[4]、印度洋和中國(guó)東南海暴發(fā)形成HABs[5]。我國(guó)東海從2002 年開始，幾乎每年暴發(fā)米氏凱倫藻藻華，造成魚類、貝類和其他海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的大量死亡[6]，已經(jīng)嚴(yán)重威脅到近岸海洋生態(tài)系統(tǒng)的安全。

應(yīng)對(duì)HABs 的措施大致分為兩類，即預(yù)防HABs 發(fā)生和在HABs 發(fā)生時(shí)進(jìn)行控制。大量用于防治和控制赤潮發(fā)生的研究集中在物理、化學(xué)和生物學(xué)方法[7]。其中，海洋植物（藻類等）、沉水植物和紅樹植物的代謝產(chǎn)物（化感物質(zhì)）等生物學(xué)方法具有污染程度小、容易降解、對(duì)近海海洋生態(tài)系統(tǒng)微生物群落干擾較小[7]等特點(diǎn)，為防治和控制HABs的發(fā)生提供新的方向[8]。

原兒茶酸（protocatechuic acid，PA）存在于多種紅樹植物中，海芒果（Cerbera manghas）中含有大量的PA[9-10]。PA 具有抗癌、抗衰老、抗病毒、抗菌，以及保護(hù)肝臟、腎臟的功能[11]，與其他酚酸類物質(zhì)可以通過植被腐爛、植物根系分泌等方式釋放到海洋壞境中[12]。葉綠體是決定藻類光合能力的關(guān)鍵，其對(duì)環(huán)境脅迫最為敏感[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，化感物質(zhì)可以促進(jìn)自由基和活性氧（reactive oxygen species,ROS）的生成，進(jìn)而對(duì)藻細(xì)胞的細(xì)胞器產(chǎn)生損傷。當(dāng)持續(xù)暴露或者化感物質(zhì)濃度較高時(shí)，細(xì)胞無(wú)法清除自由基和活性氧，因此，藻細(xì)胞表現(xiàn)出氧化損壞或死亡的情況[14-15]。同時(shí)，多環(huán)芳烴和重金屬等污染物可破壞植物葉綠體，降低光合效率[16-17]，而光合能力的強(qiáng)烈抑制勢(shì)必會(huì)延緩藻類的生長(zhǎng)和發(fā)育，達(dá)到抑制藻類生長(zhǎng)的目的，進(jìn)而控制赤潮發(fā)生。

為了探討紅樹植物及其主要抑藻物質(zhì)對(duì)赤潮藻的抑制效應(yīng)，以及對(duì)赤潮藻的光合系統(tǒng)PSⅡ的抑制機(jī)制，本研究開展了紅樹植物果實(shí)水提液及其主要抑藻物質(zhì)對(duì)米氏凱倫藻生長(zhǎng)、光合系統(tǒng)PSⅡ的抑制作用及機(jī)制研究，探尋不同濃度水提物和抑藻物質(zhì)對(duì)赤潮藻光合作用的生理學(xué)差異，闡明紅樹植物及其主要抑藻物質(zhì)對(duì)赤潮藻的生理學(xué)機(jī)制，以期為防治赤潮發(fā)生提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 赤潮藻的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)藻種米氏凱倫藻（Karenia mikimotoiGY-H36）購(gòu)置于上海光語(yǔ)生物科技有限公司，保種于暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院。

藻種培養(yǎng)：接種于f/2 滅菌培養(yǎng)基中（表1），培養(yǎng)于人工氣候培養(yǎng)箱（新苗GZX-300BSH-Ⅲ，上海），其中海水配制采用人工海鹽（Dragon King，廣州）配制鹽度為 29±1。照度設(shè)置為 100 μmol·m-2·s-1，光暗周期比12 h∶12 h，溫度為（20±1）℃，每天輕輕搖晃并交換位置3 次。

1.2 海芒果果實(shí)水提物的制備

海芒果（C.manghas）果實(shí)采集于珠海市淇澳島紅樹林自然保護(hù)區(qū)。新鮮果實(shí)收集后，用蒸餾水洗凈，擦拭干凈，去果核，再經(jīng)-80 ℃冷凍干燥（Wizard 2.0，Virtis，美國(guó)），用打粉機(jī)將凍干后的果實(shí)打成干粉備用。

稱量100 g 海芒果干粉加入到2 L 已滅菌的f/2培養(yǎng)基中?；旌衔锓饪诤蠼?jīng)70 ℃水浴加熱24 h，再超聲處理2 h，得到渾濁的褐色水提物。把該水提物經(jīng)過濾紙過濾除渣，再經(jīng)過孔徑0.22 μm 濾膜過濾以去除微生物，4 ℃下避光保存。母液濃度為50 g·L-1。

1.3 海芒果提取物抑藻率的計(jì)算

將海芒果果實(shí)水提物母液（50 g·L-1）按梯度稀釋至0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10 g·L-1，總體系為50 mL（表2）。米氏凱倫藻接種濃度為4.5×104L-1，每組設(shè)置3 個(gè)平行。每日取樣1 mL 用體積分?jǐn)?shù)4%的甲醛固定進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)算抑制率IR，公式如下：

表2 海芒果提取物抑藻率實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Experimental design of algae inhibition

1.4 原兒茶酸母液的制備

購(gòu)買原兒茶酸（TargetMol，美國(guó)，99.9%，CAS:99-50-3）標(biāo)準(zhǔn)品用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。配置10 g·L-1的母液，按梯度稀釋至25、50、75、100、125 mg·L-1，總反應(yīng)體積為50 mL。抑制率計(jì)算方法同1.3 節(jié)。

1.5 葉綠素快速熒光參數(shù)的測(cè)定

取2 mL 藻液于植物效率儀反應(yīng)杯中，室溫下遮光暗適應(yīng)20 min。采用手持式植物葉綠素快速熒光儀（Handy Plant Efficiency Analyzer,Handy PEA,Hansatech,英國(guó)）檢測(cè)葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)。

Handy PEA 使用過程：設(shè)置參數(shù) 3 000 μmol·m-2·s-1，增益為1.0×。用f/2 培養(yǎng)基將儀器調(diào)零后，將反應(yīng)杯放入液體檢測(cè)器中，測(cè)定葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)（OJIP）指標(biāo)。通過分析得到OJIP曲線及相關(guān)光合系統(tǒng)Ⅱ電子傳遞相關(guān)參數(shù)。JIP-test相關(guān)參數(shù)和計(jì)算公式[19-20]見表3。

表3 JIP-test 相關(guān)參數(shù)和計(jì)算公式Table 3 Parameters and formulas of JIP-test

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3 組平行實(shí)驗(yàn)分析所得，并采用平均值±SD 表示。組間差異顯著性分析采用One-way ANOVA 和LSD（SPSS statistics 25，IBM）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜ 0.05 為差異顯著。使用origin 8.5進(jìn)行分析制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 海芒果果實(shí)水提物及其抑藻物質(zhì)對(duì)米氏凱倫藻生長(zhǎng)的影響

海芒果果實(shí)水提物可顯著抑制米氏凱倫藻的生長(zhǎng)（圖1_A），且呈現(xiàn)出“低濃度促進(jìn)、高濃度抑制”現(xiàn)象以及典型的“劑量-效應(yīng)”關(guān)系，即低質(zhì)量濃度（0.625 g·L-1）時(shí)促進(jìn)藻類生長(zhǎng)，當(dāng)質(zhì)量濃度逐漸升高時(shí)，抑制率顯著增加。圖1_B 顯示，在海芒果果實(shí)水提物質(zhì)量濃度為5 g·L-1，暴露120 h時(shí)，對(duì)米氏凱倫藻的抑制率為（99.87±0.04）%，已經(jīng)達(dá)到完全抑制的效果。原兒茶酸對(duì)米氏凱倫藻也有顯著的抑制效應(yīng)（圖1_C），在暴露120 h 時(shí)，質(zhì)量濃度為25、50 mg·L-1的原兒茶酸對(duì)米氏凱倫藻出現(xiàn)了顯著的抑制作用，但原兒茶酸質(zhì)量濃度為25 mg·L-1時(shí)抑制率較低，為（17.82±2.58）%（圖1_D）。隨著質(zhì)量濃度的升高，其抑制率逐漸增加，至75 mg·L-1時(shí)，已經(jīng)出現(xiàn)了完全抑制效應(yīng)。

圖1 海芒果果實(shí)水提物及其只要抑藻物質(zhì)原兒茶酸對(duì)米氏凱倫藻的生長(zhǎng)影響及120 h 抑制率Fig.1 Growth and 120 h inhibitory effects of fruit water extract and PA of Cerbera manghas L.on Karenia mikimotoi

2.2 海芒果果實(shí)水提物對(duì)米氏凱倫藻光合作用的影響

圖2 描述了海芒果果實(shí)水提物對(duì)米氏凱倫藻光合系統(tǒng)Ⅱ相對(duì)熒光值的影響。隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，米氏凱倫藻相對(duì)熒光值逐漸增加。在暴露48、72 h時(shí)，0.625、1.25 g·L-1的海芒果果實(shí)水提物對(duì)米氏凱倫藻的影響出現(xiàn)典型的“低濃度促進(jìn)、高濃度抑制”的現(xiàn)象。10 g·L-1的海芒果果實(shí)水提物出現(xiàn)了最高抑制光合系統(tǒng)Ⅱ相對(duì)熒光產(chǎn)量的情況，在48 h時(shí)，其J-I-P相迅速下降；在120 h 時(shí)，熒光產(chǎn)量幾乎完全消失。

圖2 海芒果果實(shí)水提物對(duì)米氏凱倫藻葉綠素快速熒光動(dòng)力學(xué)曲線的影響Fig.2 Rapid increase in fluorescence transients for Karenia mikimotoi exposed to fruit water extract for Cerbera manghas

為進(jìn)一步了解海芒果果實(shí)水提液對(duì)米氏凱倫藻光合系統(tǒng)Ⅱ的影響，通過公式計(jì)算得到JIP-test相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并得到以下結(jié)果（圖3）。反應(yīng)中心密度指標(biāo)RC/CS0在高質(zhì)量濃度組（5、10 g·L-1）均顯著低于對(duì)照組，且隨質(zhì)量濃度上升而下降。單位激發(fā)界面能量通量相關(guān)指標(biāo)（ABS/CS0、DI0/CS0、ET0/CS0、TR0/CS0）在高質(zhì)量濃度組，120 h 時(shí)均出現(xiàn)了不同程度的下降，且隨著質(zhì)量濃度的上升而下降。與QA還原光合系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心能量通量的數(shù)據(jù)顯示，120 h 時(shí)，TR0/RC 無(wú)顯著差異，高質(zhì)量濃度處理組（5、10 g·L-1）的DI0/RC 和ABS/RC 均顯著低于對(duì)照組。熒光產(chǎn)量和通量比相關(guān)指標(biāo)φP0、φE0和0ψ中，中高質(zhì)量濃度組（2.5、5 g·L-1）φE0和0ψ出現(xiàn)上升的趨勢(shì)，而10 g·L-1的處理組則顯示出下降的現(xiàn)象；φP0則表現(xiàn)出隨著質(zhì)量濃度增加，值也相對(duì)增加的情況。

圖3 海芒果果實(shí)水提物對(duì)米氏凱倫藻葉綠素a 熒光瞬時(shí)-JIP 參數(shù)的影響Fig.3 Effect of fruit water extract for Cerbera manghas on chlorophyll a fluorescence transient-JIP parameters in Karenia mikimotoi

2.3 原兒茶酸對(duì)米氏凱倫藻光合作用的影響

海芒果果實(shí)水提物中抑藻物質(zhì)含量較多的原兒茶酸對(duì)米氏凱倫藻光合系統(tǒng)Ⅱ相對(duì)熒光值的影響（圖4）。隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)，米氏凱倫藻的相對(duì)熒光值逐漸增加。原兒茶酸抑藻過程中并未出現(xiàn)海芒果果實(shí)水提物“低促高抑”現(xiàn)象。在24 h 時(shí)，125 g·L-1處理組中J-I-P 相迅速下降，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低。其他各組均隨著質(zhì)量濃度的升高，其相對(duì)熒光值出現(xiàn)了逐漸下降的趨勢(shì)。120 h 時(shí)，50 g·L-1的原兒茶酸就已經(jīng)對(duì)米氏凱倫藻出現(xiàn)顯著的抑制情況。

圖4 原兒茶酸對(duì)米氏凱倫藻葉綠素快速熒光動(dòng)力學(xué)曲線的影響Fig.4 Rapid increase in fluorescence transients for Karenia mikimotoi exposed to Protocatechuic acid

反應(yīng)中心密度指標(biāo)RC/CS0在中高質(zhì)量濃度組（25～ 125 g·L-1）均顯著低于對(duì)照組（圖5_E），且隨質(zhì)量濃度上升而下降，同時(shí)，25 g·L-1的RC/CS0略高于對(duì)照組。單位激發(fā)界面能量通量相關(guān)指標(biāo)（ABS/CS0、DI0/CS0、ET0/CS0、TR0/CS0）在中高質(zhì)量濃度組（25～ 125 g·L-1），24～ 120 h 時(shí)，均出現(xiàn)隨質(zhì)量濃度的上升而下降現(xiàn)象（圖5_B-E）。與QA還原光合系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心能量通量的數(shù)據(jù)顯示，120 h 時(shí)，高質(zhì)量濃度組（125 g·L-1）TR0/RC 出現(xiàn)增加現(xiàn)象，其他各處理組均無(wú)顯著變化。高質(zhì)量濃度組（125 g·L-1）的DI0/RC 和ABS/RC 均顯著高于對(duì)照組，其他組與對(duì)照組均無(wú)顯著變化。熒光產(chǎn)量和通量比指標(biāo)中，φP0無(wú)顯著變化。中質(zhì)量濃度組（50、75 g·L-1）φE0和0ψ出現(xiàn)上升趨勢(shì)，高質(zhì)量濃度組（125 g·L-1）則顯示下降現(xiàn)象。

圖5 原兒茶酸對(duì)米氏凱倫藻葉綠素a 熒光瞬時(shí)-JIP 參數(shù)的影響Fig.5 Effect of Protocatechuic acid on chlorophyll a fluorescence transient-JIP parameters in Karenia mikimotoi

3 討論

本研究結(jié)果表明，海芒果果實(shí)提取物及其主要化感物質(zhì)可顯著抑制常見赤潮藻米氏凱倫藻的生長(zhǎng)，且能干擾米氏凱倫藻光合效能。相關(guān)研究也證實(shí)許多植物的組織、提取物、分泌物和代謝產(chǎn)物等可抑制藻類生長(zhǎng)[21-23]。海芒果為一種半紅樹植物，我國(guó)東南沿海、南海北部沿岸均廣泛分布，其生態(tài)位與赤潮藻暴發(fā)時(shí)期的生態(tài)位部分重疊。因此，海芒果在赤潮防治中有獨(dú)特的研究空間和研究?jī)r(jià)值。

化感物質(zhì)會(huì)影響藻類光合系統(tǒng)，甚至?xí)绊懙紸TP 的合成[24]。本研究也發(fā)現(xiàn)，隨著濃度的逐漸升高，米氏凱倫藻的熒光動(dòng)力學(xué)曲線J-I-P 相明顯下降，說(shuō)明海芒果果實(shí)水提物和PA 均會(huì)抑制米氏凱倫藻的光系統(tǒng)PSⅡ的光活化。有研究發(fā)現(xiàn)，I-P 相降低是因?yàn)镼B非還原中心比例增加導(dǎo)致的QA到QB的電子轉(zhuǎn)移受阻而引起的[25]。且隨著濃度的增加，F(xiàn)0、Fi、Fj和Fm均出現(xiàn)逐漸降低的情況，說(shuō)明PSⅡ供體側(cè)的電子轉(zhuǎn)移受阻逐漸嚴(yán)重[26]。F0的逐漸降低可能是藻密度降低所引起的，然而O-I-J 相的降低可能是因?yàn)镻SⅡ中天線復(fù)合體結(jié)構(gòu)受損，同時(shí)抑制了PSⅠ的活性，進(jìn)而導(dǎo)致電子轉(zhuǎn)移受阻[27-28]。這與本課題之前的研究結(jié)果相類似[19]，也與其他重金屬、多環(huán)芳烴、高溫等脅迫的研究結(jié)果相似[29-30]。因此，可推斷海芒果果實(shí)水提物和PA 與可能導(dǎo)致米氏凱倫藻光系統(tǒng)PSⅡ的供體和受體側(cè)結(jié)構(gòu)和功能受損，天線復(fù)合體電子傳遞受阻有關(guān)。

中高質(zhì)量濃度組ABS/CS0、DI0/CS0、ET0/CS0、TR0/CS0等參數(shù)的降低，表明水提液和PA 能夠抑制米氏凱倫藻光合系統(tǒng)對(duì)電子的吸收、電子傳遞；而DI0/RC 和ABS/RC 的增加，則表明了耗散和每反應(yīng)中心吸收值的增加。筆者此前的研究發(fā)現(xiàn)，在96 h時(shí)，稀土元素鑭對(duì)微藻的DI0/RC 和ABS/RC 并無(wú)顯著變化[19]。有研究顯示，ABS/RC 的增加表明了反應(yīng)中心失活，或者反應(yīng)中心PSⅡ受到抑制或損傷[30]，而ABS/RC 的增加往往會(huì)導(dǎo)致DI0/RC 的增加，而DI0/RC 的增加進(jìn)一步導(dǎo)致ROS 的產(chǎn)生，引起光合器的過氧化損傷[31]。因此，可推測(cè)高質(zhì)量濃度組的DI0/RC 增加加速了ROS 的產(chǎn)生，引起了光合器的過氧化損傷加重；而中低質(zhì)量濃度組DI0/RC 降低可以有效緩解脅迫帶來(lái)的過氧化損傷，這可能是米氏凱倫藻受脅迫后的一種自我調(diào)控保護(hù)機(jī)制。此外，PA 處理組中光合性能指數(shù)（Performance Index，PI）φE0和0ψ下降可能由光合系統(tǒng)中能量吸收、捕獲和電子轉(zhuǎn)移受阻引起[32]。

4 結(jié)論

本研究證明海芒果果實(shí)水提物及其主要物質(zhì)原兒茶酸可以有效抑制米氏凱倫藻的生長(zhǎng)。米氏凱倫藻受到脅迫后，其光合系統(tǒng)Ⅱ的反應(yīng)中心密度、單位激發(fā)界面能量通量和QA還原光合系統(tǒng)反應(yīng)中心均發(fā)生了變化，最終導(dǎo)致光合系統(tǒng)電子傳遞和電子吸收障礙，進(jìn)而導(dǎo)致米氏凱倫藻生長(zhǎng)受到抑制。這些結(jié)果表明海芒果及原兒茶酸可以作為一種有效防治赤潮發(fā)生的天然抑藻物質(zhì)，以期為我國(guó)近海岸赤潮防治提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。