劉瑞娟，李澤運，劉帥兵，孫素珂，王素云，張曉堅，田 鑫

鄭州大學第一附屬醫(yī)院藥學部 鄭州 450052

利伐沙班是一種口服的凝血因子Ⅹa直接抑制劑，可中斷凝血級聯(lián)系統(tǒng)的內源性和外源性途徑，同時抑制凝血酶生成和血栓形成[1-2]；臨床上用于預防成人髖或膝關節(jié)置換手術后靜脈血栓形成以及降低深靜脈血栓復發(fā)和肺栓塞的風險等[3-6]。與傳統(tǒng)的抗凝劑相比，利伐沙班具有生物利用度高、可預測藥動學和藥效學特征、治療期間無須密切監(jiān)測和調整劑量、不良反應少等優(yōu)點，在臨床上得到了廣泛應用[7]。國內許多藥企進行了利伐沙班仿制藥的注冊申請，國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心藥物臨床試驗登記與信息公示平臺已登記的利伐沙班相關研究有60余項。本研究旨在建立人血漿中利伐沙班濃度的液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)檢測方法，研究利伐沙班片受試制劑在中國健康受試者體內的藥動學特征并評價其生物等效性，同時考察高脂飲食對利伐沙班在中國健康人體內藥動學特征的影響。

1 材料與方法

1.1藥品與主要試劑利伐沙班標準品(批號：14-XJZ-49-1，含量：99.54%)和利伐沙班-d4標準品(同位素內標，批號：9-JHY-173-5，含量：98%)均購自Toronto Research Chemicals Inc.，受試制劑利伐沙班片(上海某藥業(yè)有限公司，規(guī)格：20 mg；T)，參比制劑利伐沙班片(Bayer Pharma AG公司，規(guī)格：20 mg；R),甲醇和乙腈(德國Merck公司)為色譜純,甲酸和異丙醇等其他試劑均為市售色譜純，試驗用水為去離子純化水，人空白血漿來自Bioreclamation IVT公司。

1.2主要儀器超高效液相色譜系統(tǒng)(Acquity UPLC，美國Waters公司)，API 6500質譜儀(美國應用生物系統(tǒng)公司，配備有Turbo-Ionspray電噴霧離子源及AnalystSoftware 1.6.3數(shù)據處理軟件)，振蕩器(德國IKA公司)，離心機(德國Eppendorf公司)，電子天平(德國Sartorius公司)。

1.3對照品溶液的配制精密稱取利伐沙班對照品適量，經質量校正后，用適當體積的二甲基亞砜溶解混勻，得到質量濃度為1.0 g/L的儲備液。用體積分數(shù)50%乙腈溶液稀釋該儲備液得到系列利伐沙班對照品溶液。同法，配制50.0 μg/L的利伐沙班-d4內標溶液。配制好的溶液置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4LC-MS/MS測定方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Luna Omega Polar C18(50.0 mm× 2.1 mm，1.6 μm)；柱溫：60 ℃；進樣量：5.0 μL；流動相A：體積分數(shù)0.1%甲酸水溶液，流動相B：體積分數(shù)0.1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脫程序：0～1.20 min，22%～95% B；1.20～1.40 min，95% B；1.40～1.41 min，95%～22% B；1.41～1.50 min，22% B；流速：0.6 mL/min。

1.4.2 質譜條件 離子檢測方式為多反應監(jiān)測(MRM)；離子化方式為氣動輔助電噴霧離子化；監(jiān)測模式為正離子方式；離子噴射電壓：5 500 V；氣簾氣：50 psi；離子源氣體1：55 psi；離子源氣體2：50 psi；離子源溫度：350 ℃；碰撞氣：10 units；駐留時間：80 ms；利伐沙班和利伐沙班-d4(內標)的去簇電壓分別為95和105 V，碰撞能量均為34 V，碰撞室入口電壓均為10 V，出口電壓分別為7和11 V；監(jiān)測離子對分別為質荷比(M/Z) 436.0 →M/Z 145.0(利伐沙班)和M/Z 440.0 → M/Z 145.0(利伐沙班-d4)。

1.5待測血漿樣品預處理精密量取30 μL血漿樣品置于96孔板中，加入20.0 μL利伐沙班-d4內標溶液，渦旋混合均勻，再加入250 μL含有體積分數(shù)0.1%甲酸的乙腈溶液，渦旋混合均勻，于4 000 r/min(半徑為9.5 cm)，4 ℃低溫離心10 min，移取上清液100 μL，轉移至新的96孔板中，加入200 μL體積分數(shù)50%甲醇水溶液，封板，振搖10 min，充分混勻。

1.6方法學確證

1.6.1 標準曲線和定量限 取空白血漿適量，分別精密加入適量利伐沙班的系列對照品溶液，配制含利伐沙班質量濃度為1.00、2.00、10.00、50.00、100.00、250.00、500.00和600.00 μg/L的標準含藥血漿，按1.5項下操作，進行LC-MS/MS測定。記錄色譜圖。計算利伐沙班峰面積/內標峰面積的比值f。以f值為縱坐標，利伐沙班血藥濃度C為橫坐標，用加權最小二乘法(W=1/x2)進行線性回歸計算，得標準曲線。

1.6.2 專屬性 分別取6份不同來源的空白血漿30 μL，用20.0 μL體積分數(shù)50%乙腈溶液代替內標溶液，進行LC-MS/MS檢測，得到空白血漿色譜圖。將利伐沙班標準品和內標溶液分別加入空白血漿后，同法操作，得血漿樣品色譜圖。

1.6.3 殘留效應 分別制備空白血漿和定量上限(ULOQ)濃度的含藥血漿樣品，進行LC-MS/MS分析。先進樣分析含藥血漿樣品后，再進樣空白血漿樣品，記錄色譜圖，評估殘留。殘留=空白血漿樣品的平均峰面積/樣品的平均峰面積×100%。

1.6.4 精密度和準確度 制備含利伐沙班的定量下限(LLOQ)、低質量濃度(LQC)、幾何中間質量濃度(GMQC)、中質量濃度(MQC)、高質量濃度(HQC)血漿樣品，質量濃度分別為1.00、3.00、30.00、200.00和450.00 μg/L，每個質量濃度平行配制6份,共做3個分析批，計算實測濃度及實測濃度準確度，計算批內和批間精密度。

1.6.5 稀釋可靠性 制備3 000 μg/L的利伐沙班標準含藥血漿樣品6份，用空白血漿將其稀釋10倍后檢測，將實測質量濃度乘以稀釋倍數(shù)得到稀釋前樣品質量濃度值，計算準確度和精密度。

1.6.6 基質效應和提取回收率 取6份不同來源的空白血漿，不加內標進行預處理，制備空白血漿基質溶液。提取100 μL上清液后加入200 μL含適量利伐沙班及內標的體積分數(shù)50%甲醇水溶液，使其質量濃度與萃取后真實質控樣品(3.00、200.00和450.00 μg/L)中利伐沙班和內標的理論質量濃度相同，進行LC-MS/MS分析，記錄利伐沙班和內標峰面積(A1和A2)并計算平均值(B1和B2)；以水代替空白血漿進行LC-MS/MS分析，其余操作同上，每個濃度平行配制6份，記錄利伐沙班和內標峰面積并分別計算平均值(C1和C2)。配制3.00、200.00和450.00 μg/L的標準含藥血漿樣品，每種質量濃度配制6份，進行LC-MS/MS分析，記錄利伐沙班和內標峰面積(D1和D2)。利伐沙班ME計算公式為ME1(%)=A1/C1×100%，內標的ME的計算公式為ME2(%)=A2/C2×100%。內標歸一化ME=ME1/ME2。提取回收率R=D1(D2)/B1(B2)×100%。

1.6.7 穩(wěn)定性 配制低和高兩個質控質量濃度(3.00和450.00 μg/L)的標準含藥血漿樣品若干組，每組6個樣品，分別在室溫放置25 h、-20 ℃和-80 ℃條件下反復凍融5次、-20 ℃和-80 ℃冰凍條件下放置一定時間后進行預處理，預處理后的樣品在進樣器(8 ℃)樣品盤中放置一定時間后進樣檢測，考察其穩(wěn)定性。同時考察了利伐沙班儲備液和工作液分別在室溫放置24 h、-20 ℃冷凍保存的穩(wěn)定性(n=6)。

1.7利伐沙班在中國健康人體內的藥動學特征和生物等效性分析

1.7.1 試驗對象 空腹試驗入組20名健康受試者(2女，18男)，均為漢族，年齡20～38(27.2±6.0)歲，身高164.0～185.5(174.3±5.0) cm，體重54.3～80.9(66.0±8.0) kg，體重指數(shù)(BMI)19.1～25.2(21.6±1.7) kg/m2。餐后試驗入組20名健康受試者(2女，18男)，均為漢族，年齡19～36(27.2±4.6)歲，身高152.5～191.0(172.3±7.5) cm，體重49.8～85.2(66.7±8.0) kg，BMI 19.6～25.4(22.4±1.5) kg/m2。受試者試驗前兩周內未服用過任何藥物，篩選期體格檢查、生命體征、實驗室檢查、血清學檢查、12導聯(lián)心電圖等體檢結果均正?；虍惓o臨床意義。該試驗方案經鄭州大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(倫理批件號：藥-2017-08)，受試者在試驗前均簽署知情同意書。

1.7.2 試驗方案 采用單中心、開放、隨機、單次口服、兩制劑、兩序列、四周期、全重復交叉試驗設計?？崭乖囼灪筒秃笤囼灨?0例健康受試者，分別隨機分為A、B兩組，A組服藥順序為TRTR，B組服藥順序為RTRT，每兩周期間的清洗期為7 d。受試者于每周期用藥前1 d入?、衿诓》浚邮苌w征、血清肌酐、凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)檢查和乙醇測試，女性受試者加查尿HCG，以確定是否可以接受該周期用藥。服藥前禁食至少10 h，不禁水。次日晨，空腹試驗受試者在空腹狀態(tài)下用240 mL溫開水送服1片(20 mg)利伐沙班受試制劑或參比制劑。服藥前、后1 h內禁水，服藥后4 h統(tǒng)一進食標準餐。在每次服藥前1 h內和服藥后0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10、12、15、24和36 h從肘靜脈采集血樣4 mL，分離血漿，放置-70 ℃冰箱中保存待測。餐后試驗在試驗當天早晨進食高脂餐(30 min內吃完)，餐后口服20 mg利伐沙班片受試制劑或參比制劑，其余操作同空腹試驗。高脂餐能量要求滿足我國人體生物等效性研究技術指導原則的相關規(guī)定[8]。

1.8數(shù)據分析與處理測得的血漿中利伐沙班的質量濃度數(shù)據，利用Phoenix WinNonlin 7.0軟件(Pharsight Company 7.0)采用非房室模型計算得藥動學參數(shù)，采用SAS 9.4對利伐沙班的藥動學參數(shù)AUC和Cmax經對數(shù)轉換后進行生物等效性分析，評估空腹和餐后口服20 mg利伐沙班受試制劑和參比制劑的生物等效性。

2 結果

2.1方法學確證結果

2.1.1 標準曲線和定量限 標準曲線回歸方程為f=0.028 39C+0.003 14(R2=0.998 9)，在1.0 ～600.0 μg/L內線性關系良好。

2.1.2 專屬性 利伐沙班和內標的保留時間均為0.7 min，色譜峰峰形良好，血漿中無雜峰干擾測定；提示本方法選擇性好，能準確測定血漿中利伐沙班的質量濃度。

2.1.3 殘留效應 血漿樣品中利伐沙班和內標均無殘留效應。

2.1.4 精密度與準確度 批內和批間精密度和準確性結果見表1。由表1可知，本方法準確度的相對誤差(RE)與精密度的相對標準偏差(RSD)均小于15%，符合生物樣品分析的要求。

表1 人血漿中利伐沙班質量濃度測定方法的準確度和精密度結果(n=6)

2.1.5 稀釋可靠性 3 000 μg/L的含藥血漿樣品稀釋倍數(shù)為10時，其精密度為1.7%，準確度為97.3%～102.0%。

2.1.6 基質效應和提取回收率 結果見表2。低、中、高3個質控水平的利伐沙班提取回收率均值范圍為95.4%～97.9%，內標的提取回收率為(95.9±2.9)%。3個質控水平的ME均值范圍為95.0%～100.0%，RSD不大于2.3%。表明該方法回收率穩(wěn)定，無基質效應的影響。

表2 血漿中利伐沙班的回收率和歸一化基質效應考察結果

2.1.7 穩(wěn)定性考察 不同儲存條件下人血漿中利伐沙班穩(wěn)定性考察結果見表3，在實驗考察的條件下穩(wěn)定性良好。此外，利伐沙班儲備液在室溫放置24 h、-20 ℃冷凍保存40 d的條件下均穩(wěn)定，相對誤差分別為-1.1%和-0.8%。

表3 不同儲存條件下人血漿中利伐沙班穩(wěn)定性考察結果(n=6)

2.2藥動學結果空腹試驗中1名受試者在第3周期給藥前退出試驗，餐后試驗20名受試者全部完成試驗?？崭乖囼炑帩舛?時間曲線見圖1；餐后試驗血藥濃度-時間曲線見圖2。利伐沙班的藥動學參數(shù)見表4和表5。對表4和表5中空腹和餐后兩種狀態(tài)下利伐沙班的藥動學參數(shù)進行比較，與空腹相比，餐后狀態(tài)下利伐沙班的暴露量(Cmax和AUC)增加，達峰時間延長，半衰期縮短。餐后狀態(tài)下利伐沙班受試制劑和參比制劑的Cmax分別增大85.2%和80.2%，AUC0～36分別增大48.1%和39.3%。

圖1 空腹試驗血藥濃度-時間曲線

圖2 餐后試驗血藥濃度-時間曲線

表4 空腹試驗利伐沙班的主要藥動學參數(shù)

表5 餐后試驗利伐沙班的主要藥動學參數(shù)

2.3生物等效性評價見表6。空腹試驗利伐沙班受試制劑和參比制劑的Tmax差異無統(tǒng)計學意義(Z=0.166，P=0.868)；餐后試驗利伐沙班受試制劑Tmax與參比制劑相比顯著延后(Z=1.964，P=0.049)。

空腹和餐后狀態(tài)下利伐沙班的藥代動力學參數(shù)統(tǒng)計分析結果顯示利伐沙班受試制劑與參比制劑Cmax和AUC的幾何均值比的90%CI均在80.00%～125.00%的生物等效性范圍內，且受試制劑和參比制劑的藥動學參數(shù)的受試者個體內變異的比值的90%CI的上限均小于2.5，表明受試制劑與參比制劑在空腹和餐后給藥時均具有生物等效性。

表6 受試制劑與參比制劑的Cmax、AUC0～t和AUC0～∞經對數(shù)轉化后的生物等效性分析結果

2.4安全性評價空腹試驗期間共6例受試者發(fā)生10例次不良事件(AE)，未發(fā)生嚴重不良事件(SAE)。受試制劑組有4例受試者發(fā)生4例次AE，AE發(fā)生率為20.00%(4/20)，參比制劑組有5例受試者發(fā)生6例次AE，AE發(fā)生率為25.00%(5/20)。AE包括與研究藥物可能無關的上呼吸道感染3例次、頭痛1例次、鼻塞1例次，與研究藥物可能有關的毛囊炎、腹痛、胃脹各1例次及與研究藥物很可能有關的胃部不適1例次。其中1例受試者服用受試制劑后上呼吸道感染為中度(2級)，其他AE均為輕度(1級)。除1例血尿轉歸為持續(xù)(受試者不愿隨訪檢查，且無任何不適)，其他AE轉歸均為消失。

餐后試驗期間共4例受試者發(fā)生7例次AE，未發(fā)生SAE。受試制劑組有3例受試者發(fā)生3例次AE，AE發(fā)生率為15.00%(3/20)，參比制劑組有1例受試者發(fā)生4例次，AE發(fā)生率為AE為5.00%(1/20)。AE包括與研究藥物可能無關的上呼吸道感染、暈針、咳嗽、咳痰、咽痛各1例次及與研究藥物可能有關的耳痛、口輕潰瘍、心電圖異常、T波地平各1例次。所有AE均為輕度(1級)，轉歸均為消失。

3 討論

3.1測定方法的選擇目前已有文獻報道采用高效液相色譜或LC-MS/MS檢測人血漿中利伐沙班濃度的方法[9-14]，但這些方法存在靈敏度低[9,11-12]、血樣預處理過程較煩瑣[9,12-13]、所需樣本體積較大或每個樣本分析時間長[11-14]等缺點。作者建立了一種新的LC-MS/MS方法。該方法僅需30 μL血漿樣品，采用蛋白沉淀法進行預處理，操作簡便，定量下限為1.0 μg/L，一個樣品的分析時間為1.5 min，適用于血漿樣品的高通量分析。

3.2試驗設計及等效性評價窄治療指數(shù)(narrow therapeutic index，NTI)藥物是指血藥濃度的微小變化可導致劑量和血藥濃度依賴性的嚴重治療失敗或不良反應的藥物[15]。針對NTI藥物的生物等效性試驗，美國、歐盟、加拿大、日本等都逐步制定了相關要求，但評價標準有所不同，且沒有統(tǒng)一的NTI藥物目錄[16]。利伐沙班是一種在療效和安全性方面均顯示出劑量-效應關系陡峭的藥物[17]，但沒有被列入已有的NTI藥物目錄中。我國2016年發(fā)布的人體生物等效性研究技術指導原則僅指出NTI藥物應根據藥物的特性適當縮小90%CI范圍，但未提及NTI藥物生物等效性試驗設計的方法[8]。參考FDA的指導原則和相關文獻[15-16]，本研究采用兩制劑、兩序列、四周期、全重復交叉試驗設計進行平均生物等效性試驗，基于參比制劑個體內變異縮窄等效區(qū)間的方法，以對比受試制劑和參比制劑的個體內變異情況，并同時滿足常規(guī)的非標定生物等效的標準。具體的評價標準參考文獻[15-16]，受試制劑與參比制劑利伐沙班的Cmax和AUC的幾何均值比的90%CI均在80.00%～125.00%，且受試制劑與參比制劑的藥動參數(shù)(Cmax和AUC)的受試者個體內變異的比值的90%CI的上限不大于2.5。

3.3利伐沙班藥動學特征本研究全面探討了中國健康受試者空腹和餐后口服20 mg后利伐沙班的藥動學特征，利伐沙班主要藥動學參數(shù)與文獻[17-19]報道的結果基本一致。有研究[7,17]證明在高加索人、非裔美國人、西班牙裔、日本人和中國人等不同種族之間利伐沙班的藥動學特征差異無統(tǒng)計學意義，臨床使用固定劑量的利伐沙班時不必考慮種族因素。然而Shaikh等[12]報道的印度健康受試者的結果與本研究有較大差異；與本研究結果相比，印度受試者空腹口服20 mg利伐沙班片后，Cmax和AUC0～t分別增加約30%和70%，可能與印度人與其他種族的體重或代謝酶差異有關，但還需進一步探討。本研究結果還顯示高脂飲食可以使利伐沙班的暴露量增加，達峰時間延長，半衰期縮短，這些變化趨勢與文獻[17]報道一致。

綜上所述，本研究建立了一種簡單、靈敏、快速、可靠的檢測人血漿利伐沙班質量濃度的LC-MS/MS方法。中國健康受試者空腹和餐后狀態(tài)下利伐沙班片受試制劑和參比制劑生物等效；高脂飲食可影響20 mg利伐沙班在體內的藥動學特征。