楊 陽,劉福榮，崔留欣,黃 輝,李福琴

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)院感染管理科 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院病案管理科 鄭州 450052 3)鄭州大學公共衛(wèi)生學院環(huán)境衛(wèi)生學教研室 鄭州 450001

近年來，世界男性精子質(zhì)量呈逐年下降趨勢，不育癥的發(fā)病率逐年升高[1]。持續(xù)霾天氣對男性生殖功能的影響引起相關(guān)學者的關(guān)注[2]。細顆粒物(PM2.5)是造成健康風險最主要的大氣污染物之一，其極易富集多種有害物質(zhì)并隨呼吸進入體內(nèi)，直接或間接對機體多個系統(tǒng)造成損傷[3]。目前PM2.5對機體損傷的研究主要集中在呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)，有關(guān)其對雄性生殖系統(tǒng)損傷的研究尚處于探索階段。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對精母細胞、睪丸結(jié)構(gòu)及精子有影響，對雄性生殖有重要調(diào)節(jié)作用[4]。肌醇需求酶1(IRE1)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的感應(yīng)蛋白之一，屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜Ⅰ型跨膜蛋白，嚴重或長時間內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可引起IRE1過量表達，進而激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)表達[5]。本研究擬通過建立PM2.5暴露雄性大鼠生殖損傷模型，觀察采用IRE1抑制劑干預(yù)后，大鼠精子質(zhì)量、組織形態(tài)、細胞凋亡、IRE1和JNK蛋白表達的變化，探討PM2.5是否通過激活I(lǐng)RE1-JNK通路介導生殖損傷，為PM2.5致雄性生殖損傷的防治提供新的思路和靶點。

1 材料與方法

1.1PM2.5采樣和處理2018年10月至2019年2月在鄭州市交通繁忙路段用大流量采樣器采集環(huán)境顆粒物，使用石英纖維濾膜進行采樣。將載有PM2.5的濾膜裁成1 cm×1 cm大小，浸泡于去離子蒸餾水中，超聲振蕩30 min×3次，振蕩液經(jīng)6層紗布過濾，12 000 r/min、4 ℃離心30 min，所得細顆粒懸浮液經(jīng)真空冷凍干燥處理后，儲存于-20 ℃?zhèn)溆?。根?jù)實驗需求在使用前24 h內(nèi)用無菌生理鹽水將PM2.5配成所需濃度后4 ℃保存，臨用前振蕩使顆粒物充分混勻。

1.2實驗動物來源及分組4周齡SPF級雄性SD大鼠40只，體重90～110 g，由河南省實驗動物中心提供，實驗動物許可證編號：SCXK(豫)2017-0001。IRE1抑制劑STF083010購自美國MCE公司。大鼠于SPF級動物房飼養(yǎng)，自由飲水，經(jīng)檢疫1周無異常后，采用隨機數(shù)字表法分成4組，每組10只。空白對照組氣管滴注生理鹽水；STF083010組腹腔注射1 mg/kg STF083010；PM2.5組氣管滴注PM2.5，劑量1.5 mg/kg；STF083010+PM2.5組先腹腔注射STF083010，后氣管滴注PM2.5。每周連續(xù)給藥5 d，停2 d，染毒時間為4周。

1.3標本取材染毒結(jié)束后，稱取大鼠體重，麻醉并處死后，立即打開腹腔，取睪丸、附睪，抽取腹主動脈血用于以下觀察和檢測。

1.4睪丸組織形態(tài)學觀察采用HE染色。取單側(cè)睪丸，置于體積分數(shù)10%甲醛中固定48 h，隨后依次進行組織浸蠟、切片、脫蠟水化、染色、脫水透明，干燥后于400倍光學顯微鏡下觀察生精上皮細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、管腔細胞脫落情況等。

1.5睪丸組織細胞凋亡檢測采用TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)檢測睪丸組織細胞凋亡情況，操作過程按照試劑盒說明進行。于400倍光鏡下觀察，正常細胞為藍紫色，凋亡細胞為棕色并出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、凋亡小體、細胞皺縮等。取3個視野，細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.6血清睪酮含量檢測取腹主動脈血約5 mL，3 000 r/min離心15 min，小心吸取血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎肊LISA法檢測血清睪酮含量，試劑盒購自上海恒遠生物科技有限公司，具體按試劑盒說明操作。

1.7精子質(zhì)量分析用眼科鑷剝離一側(cè)附睪尾，制備精子濾液。采用電腦精子分析儀分析精子密度。于400倍光鏡下觀察精子活動率。取3個視野，精子活動率=活動精子數(shù)/(活動精子數(shù)+無活動精子數(shù))×100%。于400倍光鏡下觀察精子形態(tài)，以大頭、雙頭、雙尾、卷尾、無鉤、香蕉形為精子畸形判斷依據(jù)。精子畸形率=畸形精子數(shù)/(正常精子數(shù)+畸形精子數(shù))×100%。

1.8睪丸組織IRE1-JNK通路相關(guān)蛋白檢測取適量睪丸組織制備組織勻漿，加入裂解緩沖液，12 000 r/min、4 ℃離心5 min。吸取上清即為提取的睪丸組織總蛋白，用BCA法測蛋白濃度?？偟鞍捉?jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。分別加入IRE1、JNK、p-JNK兔多克隆抗體(美國Immunoway 公司，均按1∶1 000稀釋)，4 ℃搖床振蕩過夜，次日加入HRP標記的羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，用ECL化學發(fā)光法顯色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Quanlity one軟件分析蛋白條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參，目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值即為目的蛋白的相對表達量。

1.9統(tǒng)計學處理采用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。4組大鼠的精子質(zhì)量，血清睪酮含量，睪丸組織細胞凋亡率以及IRE1、JNK和p-JNK蛋白表達水平的比較采用2×2析因設(shè)計的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠睪丸組織形態(tài)學觀察結(jié)果空白對照組(圖1A1)生精細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，生精小管充實飽滿，管壁光滑無皺褶，管腔細胞無脫落。STF083010組(圖1B1)生精小管排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)正常，由不同發(fā)育階段的生精細胞和支持細胞組成，在生精小管間的睪丸間質(zhì)內(nèi)，可見圓形或多邊形的睪丸間質(zhì)細胞。PM2.5組(圖1C1)生精細胞間結(jié)構(gòu)較為疏松，管內(nèi)細胞間隙變大，生精上皮退化變性，細胞層數(shù)較空白對照組減少。STF083010+PM2.5組(圖1D1)生精細胞結(jié)構(gòu)基本完整，管內(nèi)細胞排列疏松但尚規(guī)則，管腔脫落細胞較PM2.5組減少。

A：空白對照組；B：STF083010組；C：PM2.5組；D：STF083010+PM2.5組；1：形態(tài)學觀察；2：細胞凋亡情況

2.2各組大鼠血清睪酮含量和睪丸組織細胞凋亡率的比較結(jié)果顯示，PM2.5可引起血清睪酮含量降低，睪丸組織細胞凋亡率升高；STF083010可拮抗PM2.5導致的血清睪酮含量下降和細胞凋亡，見表1。各組大鼠睪丸組織細胞凋亡情況見圖1。

表1 各組大鼠睪丸組織細胞凋亡情況

2.3各組大鼠精子質(zhì)量分析PM2.5可降低精子密度及精子存活率，增高精子畸形率；而STF083010可拮抗PM2.5導致的精子密度、精子存活率降低及精子畸形率升高，見表2。

表2 各組大鼠精子質(zhì)量結(jié)果比較

2.4各組大鼠睪丸組織中IRE1、p-JNK蛋白表達水平的比較見圖2、表3。PM2.5上調(diào)了IRE1、JNK、p-JNK蛋白表達水平，而STF083010抑制了PM2.5介導的IRE1、p-JNK蛋白表達的上調(diào)。

1～4:分別為空白對照組、STF083010組、PM2.5組、STF083010+PM2.5組

表3 各組大鼠睪丸組織中IRE1、JNK、p-JNK蛋白的表達

3 討論

PM2.5是霾形成的主要因素之一，治理霾的關(guān)鍵就是解決PM2.5問題。PM2.5粒徑小，比表面積大，易吸附重金屬等有毒有害物質(zhì)，而生殖系統(tǒng)是重金屬毒害作用的主要靶器官之一[6]。意大利一項回顧性隊列研究[7]評估了空氣污染對精子參數(shù)的影響，結(jié)果顯示，PM2.5暴露水平與精子總數(shù)呈顯著負相關(guān)。文獻[8]分析了2013至2015年武漢地區(qū)大氣顆粒物與男性精子質(zhì)量的暴露-反應(yīng)關(guān)系，結(jié)果表明，PM2.5暴露濃度與精子質(zhì)量呈負相關(guān)，尤其是精子濃度和精子數(shù)量。本研究選擇4周齡SD雄性大鼠，PM2.5染毒4周后，睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞，生精細胞數(shù)減少；睪丸組織細胞凋亡率升高；精子密度及精子存活率降低，精子畸形率升高；血清睪酮含量降低。上述證據(jù)進一步證實了PM2.5可引起雄性生殖損傷。STF083010與PM2.5聯(lián)合作用后大鼠精子質(zhì)量﹑血清睪酮含量有所升高，睪丸組織病理損傷有所減輕，凋亡細胞減少，提示STF083010干預(yù)可拮抗PM2.5暴露引起的雄性大鼠生殖損傷。

目前PM2.5暴露對睪丸損傷的作用及其確切調(diào)控機制尚未完全闡明。有學者[9]研究發(fā)現(xiàn)，汽車尾氣來源的PM2.5通過激活PI3K/AKT信號通路，誘導睪丸支持細胞活性氧水平升高、細胞功能異常，破壞血睪屏障的完整性，最終導致生殖功能損傷。IRE1是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的感應(yīng)蛋白之一。當出現(xiàn)嚴重或長時間內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，可引起感應(yīng)蛋白IRE1的過量表達，活化的IRE1可與細胞凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)形成IRE1-TRAF2-ASK1復(fù)合物，進而激活JNK[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5誘導可使大鼠睪丸組織中IRE1、JNK和p-JNK蛋白表達增強；采用IRE1抑制劑STF083010干預(yù)，在拮抗IRE1的同時，有效抑制了p-JNK蛋白表達水平，提示PM2.5可能通過活化IRE1、JNK介導雄性大鼠生殖損傷。

綜上，抑制IRE1-JNK通路可能能減輕PM2.5介導的雄性大鼠生殖損傷，這為PM2.5致生殖損傷的預(yù)防和治療提供了線索和思路。另外，JNK為MAPK家族的重要成員之一，除了與IRE1有關(guān)聯(lián)，還與自噬、氧化應(yīng)激、線粒體及炎癥因子等多條信號通路有關(guān)[11]。JNK通路是否介導了其他信號通路共同參與PM2.5暴露后的生殖損傷，有待進一步探討。